实验5巨噬细胞酸性磷酸酶的显示.docVIP

. 实验5 巨噬细胞酸性磷酸酶的显示姓名：李思露学号：131140040一、 实验目的以小鼠腹腔巨噬细胞为材料，通过显示其溶酶体代表酶酸性磷酸酶，学习酶细胞化学的一般原理及方法。二、 实验原理酸性磷酸酶是动物吞噬细胞溶酶体的标志性酶。其能分解磷酸脂（常用-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基。在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色的磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀（可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。三、 实验材料、试剂及用品（一） 材料小白鼠：68周龄小白鼠。处理1：小鼠实验前2天，腹腔注射4%淀粉肉汤1 mL诱导及活化巨噬细胞； 处理2：小鼠实验前2天，腹腔注射生理盐水1 mL。（二） 试剂（1）4淀粉肉汤：牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，可溶性淀粉4g，蒸馏水100mL，高压蒸汽灭菌20min，保存于4冰箱。 （2）10中性福尔马林（pH6.87.1）。（3）酸性磷酸酶作用液 （现配）：蒸馏水90mL，0.2mol/L乙酸缓冲液（pH4.6）12mL,5%硝酸铅2mL,3.2%-甘油磷酸钠4mL。配法：先将蒸馏水和乙酸缓冲液混合，随后成分大致相等的2份，向其中一份加硝酸铅溶液混匀，向另一份加-甘油磷酸钠溶液混匀；然后将其中一份溶液缓缓加入另一份溶液中，且边加边用玻璃棒搅拌。用乙酸调pH为4.85.0。注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀；最好在临用前配制，不能储存。（4）1硫化铵溶液。（三） 用品水浴箱（ 50， 37 ）、低温冰箱、普通光学显微镜、小剪刀、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管、载玻片染色盒（缸）、5片装玻璃染色缸、载玻片。四、 实验操作1. 巨噬细胞： 腹腔注射生理盐水2mL，3min后抽取腹腔液。2. 细胞黏附及酶灭活：每人3片，标示1、2、3。在1和2中央位置滴加处理1小鼠腹腔液23滴，在3中央位置滴加处理2小鼠腹腔液23滴；将1和3置4冰箱黏附30min，将2置湿盒（铺有数层湿纱布的不锈钢饭盒）内，50水浴或恒温箱30min，灭活酸性磷酸酶。3. 洗涤除未粘附细胞：用胶头滴管吸取生理盐水冲洗除去未粘附物。4. 固定：预冷的10中性福尔马林4固定30min。5. 自来水漂洗5min，将水甩干。6. 加酸性磷酸酶作用液反应：3730min。 7. 用自来水漂洗片刻。8. 加硫化铵反应：通风橱中，10min。9. 自来水冲洗。10. 带水加盖玻片显微观察。阳性标本细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。五、 实验结果1. 淀粉肉汤组1巨噬细胞酸性磷酸酶在显微镜下的显示图1 巨噬细胞酸性磷酸酶显示照片（胞内棕黑色为硫化铅颗粒）2. 淀粉肉汤组2巨噬细胞酸性磷酸酶在显微镜下的显示图2 失活的巨噬细胞酸性磷酸酶显示照片3. 生理盐水组巨噬细胞酸性磷酸酶在显微镜下的显示图3 生理盐水组巨噬细胞酸性磷酸酶显示照片（胞内棕黑色为硫化铅颗粒）六、 作业与思考题1. 比较注射淀粉肉汤组小鼠腹腔巨噬细胞分别经50 和4 处理后酸性磷酸酶的显示结果并解释。答：（1）注射淀粉肉汤组的小鼠腹腔巨噬细胞，在经过4和50处理后酸性粒酸酶的显示存在着明显的差异。如图1所示，经过4处理的巨噬细胞内有较多的棕黑色颗粒，而经过50（如图2）处理的巨噬细胞中则没有棕黑色颗粒。由实验原理可知，棕黑色颗粒是硫化铅颗粒，是酸性磷酸酶分解磷酸酯释放的磷酸基与铅盐反应形成磷酸铅再经过硫化铵作用形成的，棕黑色颗粒的分布显示了酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。（2）由实验结果可以看出，4处理的巨噬细胞中有较多的酸性磷酸酶，而50处理的巨噬细胞中酸性磷酸酶失活，不再能分解磷酸酯产生磷酸基，进一步产生硫化铅颗粒，所以细胞中几乎没有棕黑色颗粒出现。2. 比较预先注射和不注射淀粉肉汤组小鼠巨噬细胞酸性磷酸酶的分布与活性差异并分析原因。答：（1）由图1和图3对比可以看出，预先注射淀粉肉汤组小鼠的巨噬细胞中棕黑色颗粒更多，颜色更深，分布更广，说明淀粉肉汤组小鼠的巨噬细胞中酸性磷酸酶的活性更高。 （2）原因是注射的淀粉肉汤中含有牛肉膏、蛋白胨等，相当于异源抗原，可以使巨噬细胞区化到小鼠的腹腔中，并激活巨噬细胞，产生更多活性更强的酸性磷酸酶，在实验中的表现就是预先注射淀粉肉汤的小鼠巨噬细胞中酸性磷酸酶的分布更广，活性更强。七、反思与改进1. 作用液应在临用时现配，储存一段时间后会产生絮状沉淀，影响反应效果。2. 孵育时间过长也可发生酶扩散。3. 在用脊椎脱臼法杀死小鼠时应该注意把小鼠提起，这样更易使小鼠死亡。在解剖小鼠