Dynabeads 链霉亲和素磁珠.pptx

Dynabeads链霉亲和素磁珠M 280试剂盒检测病毒核酸 产品介绍 本公司M 280链霉亲和素磁珠是统一规格 超顺磁性的聚苯乙烯磁珠 其表面被覆单层链霉亲和素 链霉亲和素以共价方式黏附于磁珠表面 本公司提供的磁珠产品以悬浮液方式包装 每ml含10mg Dyna磁珠 磁珠的贮存液是pH 7 4的磷酸盐缓冲液 其中含0 1 BSA和0 02 叠氮钠 作为防腐剂 本公司提供不同包装规格的产品 No 112 05产品是2ml包装 No 112 06产品是10ml包装 No 602 10是100ml包装 产品介绍 链霉亲和素偶联的磁珠作为固相基质 可简便快捷 有效地与许多生物素化复合物结合 如 小分子 肽类 蛋白 抗体 糖类 凝集素 寡合核苷酸 DNA RNA等 应用本公司的磁珠收集器 DynalMPC 可高效率地收集磁珠 及随后实验操作靶分子 磁珠捕获 漂洗及检测等流程易于操作及体系优化 单层链霉亲和素以共价方式被覆在磁珠表面 确保较低的可忽略不计的失耦连率 磁珠上链霉亲和素的吸附无过多现象 能确保在您实验应用或检测中 不同批次试剂的变动小 结果重复性好 原理 链酶亲和素磁珠 加入生物素标记分子 与生物素标记的分子结合 磁珠分离后 用于下游技术 磁珠分离 免疫磁珠法分离细胞原理示意图 M 280磁珠的准备使用前 需要洗去磁珠上防腐剂 应用磁珠收集器 DynalMPC 可简化清洗程序 1 轻轻摇晃装磁珠小瓶 悬浮磁珠 获得均匀一致的悬浮液 2 根据需要 转移适当量磁珠悬浮液到备用管中 3 将管子放在磁力架1 2分 在分离过程 不要将管子从磁力架上拿下来 4 用移液器将管中上清移去 此时管置于磁力架上 避免移液器枪头触及管内壁 因磁珠附着于管内壁 5 从磁力架上取下管子 根据您的特殊用途加入合适缓冲液 让缓冲液沿管内壁 磁珠积聚处 留下并轻轻悬浮 缓冲液用量与磁珠悬浮液等体积 6 重复洗一次 步骤3 5 然后放入适当体积缓冲液配制磁珠工作液 使用说明 M 280磁珠的准备 图解 洗去防腐剂 弃掉上清液 沿管壁加入等量缓冲液 重复1次 备用液用液 轻轻摇晃 准备 1 磁力架 分离 Dynal链霉亲和素磁珠液M 280不是去RNA酶的7 向溶液A和溶液B加入DEPC 使其终浓度达0 1 用力震荡 8 室温放置1小时 高压灭菌 9 用等体积溶液A洗磁珠两次 1 3分钟10 用等体积B洗磁珠一次 11 用溶液B悬浮磁珠 RNA操作的准备 RNA操作的准备 图解 DEPC DEPC 室温静置1h 高温灭菌 洗磁珠2次 1 3min 洗磁珠1次 悬浮磁珠 溶液A DEPC处理的0 1MNaOH DEPC处理的0 05MNaCl溶液B DEPC处理的0 1MNaCI Dynal链霉亲和素磁珠M 280为多种分子水平操作 亲和提纯及各种生物检测提供了一个很好的载体 捕获靶分子有直接法或间接法 间接方法中 首先向样品中加入生物素化配体 其与特异性靶分子结合形成复合物 此复合物与用于捕获的磁珠共孵育 鉴于生物素与链霉亲和素的强亲和力 快速结合活力 间接捕获法可应用于配体 靶分子结合动力低或亲和力弱的实验中 以使非特异性结合最小化 此法还可应用于配体浓度低 配体 靶分子结合需要最适空间构象及真正液相动力学的实验中 固定程序 1 将0 1 mol荧光修饰核苷酸溶于0 7ml无菌蒸馏水中 用Aminolink2 试剂可合成5 氨基修饰寡核核苷酸 2 加入0 1ml的1 0MNaHCO3 Na2CO3缓冲液 pH值为9 0 3 用一种酯类试剂 Biotin X NHS Ester 让生物素贴附在氨基上 将10mg ml的Biotin X NHS Ester溶液溶于二甲基甲酰氨中 取配好的此溶液0 2ml加入反应混合物中 4 室温放置2小时 5 用NAP 10柱法去除痕量游离Biotin X NHSEster 6 根据厂家说明书用反相HPLC法纯化生物素化寡核苷酸 生物素化寡核苷酸引物 通过化学结合法完成5 或3 端氨修饰寡核苷酸的生物素化流程 用NAP 10柱法去除痕量游离Biotin X NHSEster 根据厂家说明书用反相HPLC法纯化生物素化寡核苷酸 PH 9 0 1ml的1 0MNaHCO3 Na2CO3缓冲液 生物素化寡核苷酸引物 0 1umol荧光修饰核苷酸 0 7ml无菌蒸馏水 将10mg ml的Biotin X NHS Ester溶液溶于二甲基甲酰氨中 取配好的此溶液0 2ml加入反应混合物中 室温放置两小时 因为游离生物素可占据磁珠上的结合位点从而降低生物素化PCR产物的结合能力 所以将游离生物素从生物素化寡核苷酸中分离出是很重要的 可首选FPLC法或反相HPLC 此纯化步骤也能确保全长脱氧寡核苷酸标记水平接近100 用生物素磷氨化法进行引物生物素化时 引物生物素化率可达70 75 即还有25 30 的引物没有被生物素化 用反相HPLC或FPLC法对生物素化引物进行回收纯化是必要的 生物素化引物的纯化 1 用B W缓冲液将磁珠洗一次 2 在离心管或微滴定孔中取整数体积洗磁珠 最后一遍洗后去除缓冲液 3 用B W缓冲液悬浮磁珠 使终浓度为5ug ul 或实验应用的适宜浓度 4 加等体积的生物素化且荧光标记的DNA探针 B W缓冲液中NaC浓度是2M 在混合物中NaCI浓度应为1M DNA所需量依赖于具体应用所需 5 室温下放置 轻轻旋转或时而轻敲离心管混合 孵育时间依赖结合的核酸长度 短的寡核苷酸 小于30个碱基 需要的孵育时间不超过10分钟 30碱基至1kb的孵育时间为15分钟 6 磁珠此时被覆了生物素化的荧光标记的DNA探针 用磁力架分离磁珠 将离心管放在磁力架上1到2分钟 7 用1倍B W缓冲液洗2 3次 用磁力架吸附磁珠以利于洗涤 推荐的是2倍浓缩液 8 悬浮磁珠 稀释至所需浓度 此时磁珠已结合了经固定化后的DNA片段 应用低盐浓度缓冲液悬浮磁珠 以利于下面的操作 核酸 核酸 图解 B W缓冲液 洗磁珠1次 在离心管或微滴定孔中取整数体积洗磁珠 弃去缓冲液 用B W缓冲液悬浮磁珠 5ug ul 加等体积的生物素化的荧光标记的DNA RNA探针 室温孵育 1 2Min 1倍B W缓冲液洗2 3次 低盐浓度缓冲液悬浮磁珠 1 取病人标本 释放出病毒核酸2 将已准备好的相应的生物素化荧光标记的DNA RNA加入释放出的病毒核酸试管中 加入聚合酶等反应物 3 孵育 待反应充分后4 免疫荧光检测5 得出结论 分析是否感染此病毒 核酸 在适宜的条件下孵育一定时间 图解 病毒裂解 释放核酸 粗提取 聚合酶等反应物 生物素和链霉亲和素之间化学键的断裂需要严格条件 例如 将复合物置入PH 8 2 含95 甲酰氨的10mMEDTA中65 C孵育5分钟或90 C孵育2分钟 超过96 生物素化DNA片段均可被特异地分离 另一种方法 可将与磁珠相连的固化靶分子置于0 1 SDS中煮沸5分钟 生物素化分子的释放 生物素化分子的释放 将复合物置入PH 8 2 含95 甲酰氨的10mMEDTA中65 C孵育5分钟或90 C孵育2分钟 将与磁珠相连的固化靶分子置于0 1 SDS中煮沸5分钟 获得磁珠 在多种技术平台中 均可自动化应用Dynal磁珠的磁性选择和操作 在网址可查找所需操作流程 AutomatedProtocols自动化操作程序 1 若需固定的生物素化DNA片段长度在1kb以上 我们推荐试剂盒Dynabeads kilobaseBINDER Kit Prod No 601 01 此试剂盒提供独特的连接液 使每mg链霉亲和素磁珠DynabeadsM 280与70pmoles浓度长4kb的生物素化DNA片段固化 与80pmoles10kb片段固化 2 所有生物素试剂均应包含一个取间隔装置以降低位阻 其长度至少6个碳原子 3 样本中游离生物素可降低链霉亲和素耦连磁珠的结合能力 Sephadex 葡聚糖柱可帮您去除样本中游离的生物素 为优化结合效率 可用反相HPLC FPLC法净化生物素化寡核苷酸引物 推荐使用5 端生物素化的引物 3 端保持游离以利于延伸 4 本产品含0 02 叠氮化钠 NaN3 作为防腐剂 吞入叠氮化钠可中毒 避免经口吸入 叠氮化钠与铅和铜反应可生成高效能炸药 金属叠氮化物 若处理过程需流经铅制排水管道 要用大量水冲洗以避免叠氮化物的阻塞 注意 本产品任何匹号的磁珠均具有典型特征 直径 2 8 m 表面积 4 8m2 g 密度 1 4g cm3 本产品中应用的重组链霉亲和素是一种分子量约为52kDa的蛋白质 1 由四个相同亚基组成 每个亚基均有一个可与生物素结合的高亲和力位点 链霉亲和素的结合特性与亲和素相同 有较少的非特异性结合 2 链霉亲和素与生物素间结合快速且牢固 一旦结合后不受pH 温度 有机溶剂及其他变性剂的影响 产品特性 结合能力 结合能力与固化的特定靶分子的大小有关 在您的样品中要确保无过量的游离生物素存在 因为游离生物素比大分子量的靶分子结合链霉亲和素快速得多在您的靶PCR产物溶液中 要确保不含过多的游离生物素化寡核苷酸 在PCR过程中 通过限定生物素化引物的浓度 或者通过超滤法 微透析法或其他清除方法去除游离生物素化引物来确保体系去除游离生物素化引物 盐浓度影响生物素化核酸与磁珠的结合能力 生物素化DNA片段 1kb 最适结合条件 终浓度为1M的NaCI 25 C 15分钟 1毫克链霉亲和素M 280磁珠可结合 700pmoles游离生物素 200pmoles生物素化寡核苷酸 5 10 g生物素化抗体 5pmoles长2 4kb的双链DNA片段 每