Aβ通过钙离子内流影响Sigma受体表达的调控作用（开题报告+论文计划）.doc

A通过钙离子内流影响Sigma受体表达的调控作用（开题报告+论文计划） 论文开题报告及论文工作计划课题名称A通过钙离子内流影响Sigma受体表达的调控作用硕硕士生学学号院（系、所）医学院专专业神经病学指导教师选题时间 1、学位论文选题的立论依据课题、选题依据和背景情况、课题研究目的、理论意义和实际应用价值课题国家自然科学基金（）选题依据和背景情况1.Sigma受体与AD以及ATF4对Sigma受体的调节Sigma受体是一种内质网膜蛋白，属于非阿片类受体，神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞都有sigma受体的表达。 Sigma受体位于内质网膜与线粒体正对的特异性膜结构MAM上。 正常情况下，Sigma受体与其结合蛋白BiP相结合，稳定在内质网膜上。 在特异性激活剂，如可卡因、镇痛新的作用下，Sigma受体与BiP分离，转移至细胞其他位置，与相应的靶蛋白结合，调节多种多样的细胞功能，这些靶蛋白包括离子通道，如细胞膜上的钾离子、钠离子和钙离子通道，蛋白激酶，如Src和TrkB，以及神经递质受体如D1R和NMDAR。 Sigma受体在细胞分化、神经再生、神经保护和认知功能等多方面调节神经功能。 能够调节细胞内钙离子信号从而调节多种神经递质的释放包括乙酰胆碱和NMDA谷氨酸系统，这两者与AD的发病及认知功能障碍密切相关。 Matsuno证实sigma受体激活剂(+)-SKF-10,047和SA4503能够增加细胞外乙酰胆碱水平。 此外，多种中枢神经系统的药物与Sigma受体有较强的亲和力如多奈哌齐、抗精神病药、五羟色胺再摄取抑制剂等等。 其中，多奈哌齐是临床上广泛应用的AD治疗药物，通过增加细胞外乙酰胆碱水平，改善AD患者的认知功能。 Sigma1受体的激活可以减轻A引起的神经毒性，减少BAX的表达和神经元死亡。 Sigma1受体激活剂还可以减轻A引起的精神抑郁，减轻东莨菪碱和A25-35引起的遗忘症。 最近有研究表明，雌激素孕烯醇酮能够逆转A所引起的认知功能下降，而这种作用是通过激活Sigma受体实现的。 新型的Sigma受体激活剂ANAVEX2-73也显示了强大的抗A所引起的认知功能障碍的作用。 临床研究表明在AD患者脑内存在明显的Sigma受体功能下降。 早在1993年，在AD患者尸检结果中，研究者发现在海马的CA1区，Sigma受体结合位点明显减低。 最近有研究利用开发的新型Sigma受体结合化合物11CSA4503，在PET研究中发现，早期AD患者即存在额叶、颞叶、枕叶、小脑和丘脑Sigma受体密度的明显减低。 可见Sigma受体功能障碍存在于AD发生和发展的全过程，对其在AD病理过程中所扮演的角色的深入研究，针对其中关键环节的有效干预必然会对AD的临床干预起到举足轻重的作用。 然而，AD患者脑内Sigma受体减低的原因目前尚不明确。 如上所述，Sigma受体密度和功能的减低可能在AD的发病中发挥重要的作用。 明确AD患者脑内Sigma受体减低的原因将有利于进一步对AD的发病的分子机制的认识，并且对AD尤其是早期认知功能障碍的干预开辟新的途径。 细胞外A的沉积是AD的主要病理变化。 为此，我们用A杏仁核注射的方法复制了AD动物模型，我们观察到动物脑内Sigma受体表达明显减低。 这说明A的干预可以导致Sigma受体表达的下降。 所需明确的是A通过哪些关键环节调节Sigma受体的表达。 虽然Sigma受体早在1973年就被克隆，并且对其激活后的细胞内转移和功能有了广泛的认识，然而对其转录、翻译以及翻译后修饰和降解方式等方面还知之甚少。 目前能够明确的是细胞内重要的转录因子ATF4是Sigma受体的转录因子。 在Sigma受体基因5端调控区（-582到-156）存在ATF4的结合区域，ATF4通过与此结合区域的直接作用，明显增加Sigma受体的表达水平。 ATF4是目前唯一证实的Sigma受体转录因子。 2.A所导致的钙离子内流可能通过DLK1调节ATF4和Sigma受体的表达ATF4是含有碱性亮氨酸拉链功能域（bZIP）转录因子，属于cAMP反应元件结合蛋白（CREB）家族，识别基因调控区域中TGACGT(C/A)(G/A)序列。 像其他CREB家族蛋白一样，ATF4含有一个碱性的DNA结构域和一个亮氨酸拉链结构域，通过后者ATF4形成自身同源二聚体或与其他蛋白形成异源二聚体，这些蛋白包括AP-1和CEBP蛋白家族。 ATF4是一个应激反应基因，其表达水平在低氧或缺氧、氨基酸剥夺、内质网应激、氧化应激等条件下明显上升。 目前，对ATF4的翻译后降解过程已经明确，ATF4的第219位丝氨酸的磷酸化致使ATF4被泛素蛋白酶体系统降解。 而SCFbTrCP这种泛素E3连接酶是降解ATF4的特异性泛素连接酶。 ATF4的磷酸化是被泛素蛋白酶体系统降解的前提。 然而，目前并未明确其特异性的磷酸化酶。 有研究证实，DAP样蛋白激酶DLK与ATF4相互作用，但DLK是否为ATF4的特异性磷酸化酶，还无定论。 为此，我们在前期工作中，用A干预共转染DLK和ATF4的293细胞系，不仅证实了DLK与ATF4有直接的相互作用，更为重要的是A的干预可以增加这种相互作用。 这提示A很有可能通过增加DLK对ATF4的磷酸化而促使其被泛素蛋白酶体系统降解，进而引起Sigma受体表达下降。 我们将在此项目中深入探讨这一问题。 DLK是钙离子调节的蛋白激酶，最近有研究证实，钙离子内流所引起的轴突生长变化必须通过DLK实现。 而对AD来说，最重要的病理变化为A的异常聚集，其神经毒性与其扰乱神经元细胞内钙离子稳态密切相关。 在AD患者脑内钙离子和钙离子相关酶的活性显著增高。 虽然目前还未完全明了A是如何引起钙离子失调的，但是有研究发现A可以插入细胞膜，形成钙离子通道而使细胞内钙离子浓度增高。 此外，A还可以与L型电压门控性钙离子通道结合，增加钙离子内流。 我们观察到的A所引起的DLK与ATF4相互作用增强是否为钙离子稳态变化所引起？这将是我们在本研究中探讨A神经毒性的出发点。 对此部分研究问题，我们归结为A是否通过增加钙离子内流而影响DLK1对ATF4的磷酸化和降解，下调ATF4的转录活性，最终下调Sigma受体的表达？课题研究目的、理论意义和实际应用价值研究目的明确A所引起的DLK/ATF4相互作用增强对ATF4转录活性和Sigma受体表达的影响，以及这种影响与钙离子内流的关系。 理论意义AD目前尚无有效治疗措施。 因此从病因学上预防AD的发生和发展，从病理机制上对AD进行深入研究，针对其中关键环节的有效干预必然会对AD的临床干预起到举足轻重的作用。 实际应用价值在AD病人早期即存在脑内Sigma受体表达的下降，而Sigma受体激动剂能够明显减低AD导致的认知功能障碍。 但目前对Sigma受体表达的调控及其与AD发生发展的关系仍不明确。 在体外神经元模型和在体AD动物模型中，运用多种分子生物学技术，从分子、细胞、以及动物整体水平探讨A对Sigma受体表达的调节作用机制。 将从A对Sigma受体表达的调节这一视点为阐释AD的发病机制提供新的思路，为AD的干预提供新的靶点。 2、文献综述国内外在该研究方向研究现状及发展动态；所阅文献的查阅范围及手段。 （文献综述不得少于1500字）国内外相关研究现状及发展动态老年性痴呆症即阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)，是老年人最常见的一种慢性大脑退行性变性疾病。 1907年首先由德国神经病理学家Alosis Alzheimer描述。 临床表现为不同程度的记忆力丧失，语言困难，定向力障碍，认知力降低，人格及行为和情感活动异常，进行性智力障碍，以至于生活不能自理完全呆傻，最后全身衰竭，并发感染而亡。 1流行病学及病理概况据统计全球有AD患者1700万2500万人，美国为200万400万人，患病率为4-6，是仅次于心血管病、癌症和脑卒中之后的第四大导致死亡的疾病。 我国老龄人口以年均3.2的速度递增，大大高于人口增长速度，60岁以上老年人口已超过l.3亿人以上。 预计到xx年将达到2.16亿人，约占总人口的16.7，年均净增老年人口800多万人。 由北京等六城市的联合调查证明我国AD发病率(4.2)与西方国家接近。 与AD有关的主要高危因素包括高龄、低教育水平、居住农村、遗传因素、慢性感染、免疫缺陷、环境毒素、代谢异常及内分泌减弱等。 其病理学特征主要表现为大脑皮层和海马区大量淀粉样老年斑块(senile plaques,SP)沉积、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)及特定脑区选择性神经元和突触丢失l-2。 与之相应的AD病因学的研究形成了以-淀粉样肽(A)、tau蛋白及神经元缺失机制为主的三大研究领域。 老年斑块(SP)的主要成分是由直径为510nm的微丝组成的-淀粉样蛋白(-amyloid protein,A)。 其他成分有载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)和胶质细胞的一些蛋白成分如-抗胰蛋白酶(ACT)、白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)和丁基胆碱脂酶等3。 2A的、分布和降解A是含3943个氨基酸残基的多肽，也有报道检测到有46个氨基酸肽链的A464。 由于其为-片层结构，分子量4kDa，经氨基酸测序，被命名为A，呈疏水性。 A其前体蛋白(amyloid precursorprotein，APP)。 断裂后产生残基多肽。 APP基因位于第2l号染色体长臂(21q21)，它至少由18个外显子组成。 分子量为105-140kDa。 编码A位于第16和17外显子。 APP基因在转录后由于不同的剪接产生10多种不同的mRNA和365770个氨基酸残基的蛋白质异构体，包括APP 695、APP 770、APP 751、APP 750、APP 714、APP 733、APP 752、APP677等。 其中APP695和APP770是人脑内的主要存在形式。 在神经细胞APP是以跨膜受体蛋白结构形式存在于细胞内外。 APP有两条生理性代谢途径。 一条途径由-分泌酶(-secretase)将A内部Lyst-16-Leu-17间的肽键切断，以阻止A的产生，同时产生一个较大的分子量约100kDa的可溶性N-末端片段和一个9kDa的APP C端部分分泌到细胞之外，称之为分泌性APP(APPsa)，可发挥一定生理作用，与细胞分化、形态改变等有关，并有促神经存活、抗兴奋性氨基酸毒性作用，所以APPsa减少在AD中与神经元退变有关。 这是APP加工的主要途径。 有人发现A本身尚具有一定的生理功能5。 进一步的研究发现，正常人脑中APP可由分泌酶(-secretase)裂解产生A序列，所以正常人的脑脊液中也可查到A，但这种正常的A是可溶性的，并不在大脑中积聚。 A从可溶状态到不溶状态的转变是AD发病机制中的关键环节6。 另一条途径是由-内分泌酶(-secretase)和-内分泌酶(-secretase)完成7。 由两种分泌酶从细胞外和细胞膜内裂解APP产生A。 多数AD患者的-分泌酶含量升高或活性增强8。 -分泌酶主要裂解APP695中的Met-595和ASP597间膜外氨基端肽键，-分泌酶主要裂解A39-43位的跨膜羧基端的任一肽键而产生分子长短不等的完整A分子。 由于A的C-末端最后几个氨基酸残基具有很强的疏水性，所以，C-端越长越易沉积。 因此，-分泌酶是决定A产生及其毒性作用的关键。 -分泌酶已被证实是膜结合的天冬氨酰蛋白酶，-分泌酶确定为presenilin- 1、presenilin-29-10。 A是各种细胞APP代谢过程中的正常产物。 中枢神经系统(S)中所有神经细胞包括神经元、星形细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和内皮细胞均可表达APP和产生A。 但在正常情况以-分泌酶途径为主。 A的产生和降解保持平衡。 人的星形细胞能产生少量APP751APP770和硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)-APP，可能是脑组织A的主要。 加之载脂蛋白E(ApoE)也主要在星形细胞表达，因此星形细胞具有重要意义。 小胶质细胞仅产生少量的APP。 大多数生成的A为A40。 同一区域不同形态和分子结构的A40神经毒性有明显差异11。 但数量较少而肽链较长的A42/A43可以聚集成纤维丝而更易聚集，可催化并与A40一起形成淀粉样斑。 内质网是生成A42/A43的主要场所，A40产生于此后的分泌性细胞器(secretory partments)，如高尔基体网络(trans-Golgiwork)。 正常时A的产生和降解保持平衡，且体内有一些因素保持A的可溶性。 A的降解与潜在活性的金属蛋白酶(latent metalloproteinase)活性有关。 该酶可明显降低A的含量。 其激动剂氨苯乙酸汞(aminophenyl mercuricacetate，APMA)可使M17细胞培养中A下降75以上，但可被抑制剂EDTA和O-Phenanthrolene阻断。 在AD脑中Ca2+依赖的金属蛋白酶增加，这些基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPS)MMP-9在海马锥体细胞中表达，存在于接近细胞外的A老年斑块附近，MMP-9激活时可裂解A跨膜区中的Leu34-Met35，降解A。 但AD脑中未被激活的这些酶增加，酶激活的缺乏可能与不溶性A沉积有关。 A40可能促进MMP- 9、MMP- 2、MMP-3的产生，也是星形细胞胶凝酶有力的诱导剂。 明胶酶(gelation)A具有仅-分泌酶的作用，也能裂解可溶性APP，产生分泌性APPsa，免疫组化证明此酶仅存在于脑白质的小胶质细胞，可能与防止A沉积有关。 新近研究显示，insulysin酶能降低AD小鼠大脑内相关蛋白质的水平，从而降低AD发病的危险12。 3A的神经毒性A是AD病理进程中真正的罪魁祸首，但可溶性A本身并无神经毒性，当-折叠形成丝状纤维聚集物变为不溶性沉淀后则具有神经细胞毒性作用，A42/A43聚集毒性更强。 动物的A保持稳定的可溶状态，故人A的一级结构是神经细胞毒性作用的决定因素。 3.1胆碱性神经元损伤向海马与大脑皮质投射的基底前区脑胆碱能系统神经元及突触的大量损伤、丧失是AD患者记忆、认知能力减退的主要原因。 A激活蛋白激酶GSK-3糖原合成酶激酶-3，引起tau蛋白及线粒体丙酮酸脱氢酶磷酸化，使酶活性降低，致丙酮酸转化为乙酰辅酶A(actyl coenzymeA)减少，从而使乙酰胆碱(ACh)合成减少13，琥珀酸脱氢酶抑制，供能减少，造成胆碱能神经元及突触损伤、退变、递质传递障碍，胆碱能系统活性下降。 而ACh的减少又导致A的产生增多，形成恶性循环。 Mey基底核等前脑底部神经受损，ACh受体破坏，致脑电活动减慢，记忆功能障碍。 胆碱能M受体激动剂可打断此恶性循环，使A形成减少，tau蛋白异常磷酸化减弱。 小鼠实验证实，A可以损伤胆碱能神经元。 体外神经元培养证明，拟胆碱药可缓解A的神经毒性作用。 乙酰胆碱脂酶(acetylcholinesterase,AchE)抑制剂仍是AD的主要治疗药物。 3.2神经细胞凋亡AD的主要特征是皮质和海马区神经元数量减少。 AD大鼠皮层神经元呈现DNA断裂等凋亡的特征性变化14。 A聚集成-片层折叠结构时神经毒性明显增强，可诱导神经细胞凋亡。 这是AD中选择性神经元和突触缺乏的重要原因。 纤维状聚集的A与APP等跨膜受体在细胞表面及分泌途径相互作用、交联，导致信号传导通路的抑制与反常激活，从而启动神经细胞死亡程序15。 A致内环境中Ca2+失衡刺激NMDA受体或者通过自由基的损伤作用导致膜通透性改变16，致Ca2+内流引起谷氨酸受体激活使谷氨酸能神经元过度兴奋而死亡。 也可导致NO合成增加引起神经细胞凋亡。 A引起AD脑易损区神经元DNA损伤，bcl-2和bax调控改变，所表达的蛋白产物异常，诱发细胞凋亡。 经线粒体途径的P53蛋白质可能诱导了AD脑内神经细胞的程序化死亡17。 A可引起培养神经元即刻早期基因(immediate earlygenes，IEGs)包括c-fos、c-jun、egr、fra- 1、fos-B、ngfi-b的过度表达，引起神经元凋亡。 研究发现在纤维母细胞凋亡过程中胞浆c-fos聚集，显示c-fos在AD发病中的作用，可能反映某些神经元死亡程序的开始。 转录因子NF-B的活性表达是SP斑块附近神经元存活的必要条件，失活后则对A的毒性异常敏感。 大量A沉积使神经元NF-B失活，同时使氧化应激超载而灭活NF-B所启动的神经元保护基因的表达，最终诱导神经细胞凋亡18。 3.3氧应激(过氧化损伤)A诱发氧应激引起自由基损伤是其重要的神经毒性。 A可通过多种途径引起氧应激19。 A诱导引起的氧应激可导致神经细胞的过氧化损伤。 A的毒性是通过H2O2介导的。 A通过进展性糖基化终产物受体(receptor ofadvanced glycationendoproduct，RAGE)增加体内H2O2的累积，产生氧化损伤，引起细胞死亡。 氧应激使小胶质细胞增殖，顺A浓度梯度迁移，导致老年斑周围小胶质细胞聚集，形成神经炎斑，产生更多活性氧种。 A增加脂质过氧化，H2O2不但是羟自由基的，而且增加快反应转录核因子(Nuclear Factor-B，NF-B)蛋白的异常表达，产生神经细胞膜损伤，导致神经元变性。 脂质自由基清除剂Vit E等许多抗氧化剂可保护神经元免受A毒性所致的类似自由基作用的细胞膜损伤。 A也可使细胞膜形成非选择性通道，使Ca2+内流增加，细胞内Ca2+稳态失调，氧化应激增强。 3.4炎症反应AD脑内有炎症反应，在SP和NFTs周围有胶质细胞增生，A可刺激释放一些具有强烈神经毒性的炎性蛋白20。 A激活星形胶质细胞和小胶质细胞释放炎症细胞因子，如一氧化氮(NO)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、-干扰素(Interfeion-,-IFN)，-抗胰蛋白酶(ACT)、补体C 1、C3及趋化因子、黏附因子等。 NO是一种强活性的自由基气体，与O2-反应生成的氧化亚硝酸盐能引起氧化应激，使脂质过氧化，破坏神经细胞膜。 同时激活NF-B，启动相应基因转录，参与炎症反应，细胞凋亡21。 A诱导小胶质细胞产生的NO可选择性损伤大脑胆碱能神经元。 IL-1能使细胞骨架蛋白-神经丝蛋白生成异常，损害神经元的功能22。 IL-6增加ADP的过高基因表达，促进A形成，A又可诱导小胶质细胞IL-6的表达，形成AD免疫病理过程中的恶性循环。 TNF-通过S最主要的载脂蛋白ApoE参与AD的病理过程。 逐多炎性因子诱导炎症反应，促进自由基生成，氧化应激，使神经细胞变性、坏死。 APP也可经酪氨酸激酶通路激活单核细胞和小胶质细胞释放炎症因子，并引起A产生和沉积23。 用非类同醇类抗炎药能延缓或防止AD，如抗炎药吲哚美辛可延缓或阻止AD的发生和发展24,25。 4结语AD的发病机制是多种因素相互作用的结果。 A在AD的发生发展中起着关键性的作用。 虽然对A在不同领域，用不同方法，在不同水平开展了大量的研究工作，也取得了很大的进展，特别是在细胞分子水平揭示了A在AD中的许多机制，但是AD的发病机制至今仍然不是十分清楚，因而还没有特效的治疗药物。 还有很多问题值得进一步地探索。 比如A的神经毒性作用机制中的多种因素之间如何协调作用，哪些途径起主要作用，也许经过不断努力的研究会发现新的因素。 随着对AD本质认识的深入，针对A神经毒性的治疗也取得了进展，比如在A疫苗、抗A纤维化沉积、和分泌酶抑制剂等药物的研究方面也富有成效，这为人类战胜AD带来了希望。 所阅文献查阅手段大学图书馆电子数据库(Pubmed、Elsevier、万方数据库、维普数据库和KI等数据库)检索；大学图书馆。 3、研究内容（ （1）学术构想与思路、主要研究内容及拟解决的关键技术学术构想与思路、主要研究内容1.明确A所引起的DLK/ATF4相互作用增强对ATF4转录活性和Sigma受体表达的影响，以及这种影响与钙离子内流的关系。 2.明确A所引起的DLK/ATF4相互作用增强是否会引起ATF4磷酸化增加，进而引起泛素化ATF4增加，促进其被蛋白酶体系统的降解；及对Sigma受体表达的影响。 拟解决的关键问题确定DLK与ATF4相互作用的功能域，根据此功能域设计多肽干预分子抑制其相互作用，观察对Sigma受体表达的影响。 利用L型电压门控性钙离子通道拮抗剂和Zn2+分别抑制钙离子通道和A形成的钙离子通道，观察A引起的钙离子内流对DLK/ATF4相互作用的影响。 （2）拟采取的研究方法、技术路线、实施方案及可行性分析研究方案及技术路线第一部分DLK/ATF4相互作用增强对ATF4降解过程的影响A）培养N2A细胞系，建立表达DLK shRNA的稳转细胞系。 B）共转染HA-泛素质粒和His-ATF4-PVAX质粒。 C）A25-35处理3天后，提取细胞蛋白，利用免疫共沉淀技术检测ATF4泛素化水平。 D）将DLK shRNA质粒构建入慢病毒载体，包装慢病毒E）体外培养小鼠皮层神经元，用上述慢病毒感染。 F）A25-35处理3天后，WB检测ATF4磷酸化水平和Sigma受体表达水平。 ICC检测Sigma受体的亚细胞定位。 第二部分DLK与与ATF4相互作用功能域的干预对ATF4磷酸化和Sigma受体表达的影响A）以氨基酸残基422-426为中心构建带HA标签的包含缺失不同片段长度的DLK质粒；与His-ATF4-PVAX质粒共转染至HEK293细胞。 B）A25-35处理3天后，提取细胞蛋白，利用免疫共沉淀技术分析DLK和ATF4相互作用的结构域。 C）根据此结构域设计干扰多肽片段，筛选与DLK作用最强的片段。 （具体方法参照Jose Aramburu1999）D）将上述多肽片段DNA序列构建入pEGFP-N1质粒，建立表达此多肽片段的稳转HEK293细胞系。 E）将His-ATF4-PVAX和Flag-DLK-PCDNA3.1质粒共转染入上述细胞系。 F）A25-35处理3天后，提取细胞蛋白，利用免疫共沉淀技术检测DLK和ATF4相互作用变化。 G）将上述质粒构建入慢病毒载体，包装慢病毒H）体外培养小鼠皮层神经元，用上述慢病毒感染。 I）A25-35处理3天后，WB检测ATF4磷酸化水平和Sigma受体表达水平。 ICC检测Sigma受体的亚细胞定位。 第三部分对钙离子内流对DLK/ATF4相互作用的影响A）培养N2A细胞系，将His-ATF4-PVAX和Flag-DLK-PCDNA3.1质粒共转染。 B）分别利用L型电压门控性钙离子通道拮抗剂Nimadipine和Zn2+分别抑制钙离子通道和A形成的钙离子通道C）A25-35处理3天后，提取细胞蛋白，利用免疫共沉淀技术检测DLK/ATF4的相互作用水平。 D）体外培养小鼠皮层神经元，用上述阻滞剂干预。 E）A25-35处理3天后，WB检测ATF4磷酸化水平和Sigma受体表达水平。 ICC检测Sigma受体的亚细胞定位。 技术路线图可行性分析实验动物大鼠国内外均已广泛使用，可顺利购得。 相关评价指标均已有实验基础，相关检测试剂、试剂盒、抗体均可由公司购得，第十人民医院中心实验室具有完善的实验设备及技术理论指导，能够保证实验顺利进行。 课题计划及预期研究结果xx.5-xx.6完成课题第一部分，检测A能否引起DLK/ATF4相互作用增强，基本明确DLK/ATF4相互作用增强促进ATF4降解的原理xx.7-xx.9完成课题第二部分，基本明确DLK与ATF4相互作用功能域的干预对ATF4磷酸化和Sigma受体表达的影响xx.10-xx.3完成课题第三部分，统计相关数据，撰写论文并投稿。 实验进程的大致时间表第第1月第第2-3月第第4月第第5-6月实验内容第一部分实验内容第二部分，A)-F)实验内容第二部分，G)-I)实验内容第三部分预期研究结果1）A通过引起钙离子内流介导的DLK/ATF4相互作用增强，促进ATF4降解和磷酸化，下调Sigma受体表达水平，最终在一定程度上缓解AD的病理过程2）在国际传统知名期刊上发表12篇SCI论文。 （3）课题的创新点本课题选取阿尔兹海默病这一国际上普遍关注但却尚未解决的难题为切入点，探讨A是否能通过增加钙离子内流而影响DLK1对ATF4的磷酸化和降解，进一步下调ATF4的转录活性，最终下调Sigma受体的作用。 国际上未见相关研究报道，为理论上的创新，若能印证，则为治疗AD新型靶点提供重要理论依据。 课题利用多种实验技术，是分子生物学、细胞学等多学科的整合研究，符合现代学科的发展方向 4、研究基础 （1）所需实验手段、研究条件和实验条件大学附属第十人民医院中心实验室设有细胞培养中心可进行细胞培养、干预等实验。 附属第十人民医院中心实验室具备本课题所需分子生物学、组织学需要的各种设备仪器，包括石蜡包埋切片机，免疫荧光技术，Western Blot分析等。 附属第十人民医院设有动物实验中心可以进行动物饲养。 （2）所需经费，包含经费、开支预算（工程设备、材料须填写名称、规格、数量）1）实验材料费（动物购买、饲养、管理以及手术器械和相关器械）20000元2）免疫组化分析，各项生物学试剂盒，抗体等购买22000元3）投稿费、劳务费等8000元总计50000元 5、主要参考文献（不少于25篇、外文不少于15篇）序号文献目录（作者、题目、刊物名、出版时间、页次）1Czech C，Tremp G，Pradiet CPresenilin andAlzheimers diseaseBiologicalfunction andpathogenic mechamsmsJProg 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