分子生物学46092846.doc

分子生物学总复习第二章 染色体与DNA真核细胞染色体与原核细胞染色体的主要区别：数量：真核数量多，原核一般只有一条位置：真核的染色体位于细胞核的核仁，原核的染色体位于拟核组成方式：真核染色体的DNA与蛋白质完全融合在一起，原核染色体外裹着稀疏的蛋白质原核生物与真核生物基因组的特点原核生物：结构简练、存在转录单元：多顺反子、有重叠基因真核生物：含有大量重复序列：（有哪几种重复序列？）、功能DNA序列大多被非功能DNA所隔开（外显子和内含子）、存在C值矛盾（C-value paradox)2.1.3 染色体的组装核小体的组成成分？核小体是如何一步一步组装成染色体的？整个过程中的压缩情况如何？2.3 DNA复制的几个基本原则半保留复制： 含义及具体过程半不连续复制：含义及具体过程；岗崎片断、前导链、随从链RNA引物：作用，为什么需要RNA引物？复制的真实性的保证： DNA复制过程中有哪些机制保证其遗传信息的稳定性DNA复制过程（原核生物为例）(掌握过程）l 确定复制的起始点l 解开双链DNA,提供单链DNA模板l 形成复制叉l DNA合成的起始和延长l 形成带有新合成的DNA片段的复制泡l 复制的终止同时需要掌握的内容DNA解开成单链的过程中，拓扑异构酶、解旋酶和单链结合蛋白分别起什么作用？ 复制叉、复制子的概念无论是原核生物还是真核生物，DNA的复制主要是从固定的起始点以双向等速复制方式进行的。 RNA引物在复制过程中的作用？引发体的大概组装过程复制的延长其化学反应的本质是生成磷酸二酯键复制的终止过程：去除RNA引物、补充空缺、用DNA连接酶连接线性DNA双链的复制和环状DNA双链的复制的常见复制类型 大肠杆菌的DNA聚合酶I和III的特点（PPT）端粒的复制端粒特征: 3端是由数百个串联重复G丰富的6个核苷酸组成端粒酶（唯一携带RNA模板的逆转录酶）的组成：蛋白质(DNA聚合酶)+RNA(合成端粒DNA的模板)大概了解端粒的复制过程DNA的损伤修复2.1 DNA损伤的原因及部位：损伤原因：复制错误、DNA重组、物理化学因子损伤部位：碱基、戊糖或是磷酸二酯键2.2 DNA损伤修复的类型：错配修复、碱基切除修复、 核苷酸切除修复、 DNA直接修复DNA转座一段DNA顺序可以从原位上单独复制或断裂下来，环化后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，此过程称转座。这段序列称跳跃基因或转座子.麦克林托克(B. McClintock)因首先在玉米中发现转座因子而获得了1983年诺贝尔医学奖。转座子的种类：插入序列、类插入序列、复合转座子、 TnA家族 第三章 生物信息的传递(上) 转录（从DNA-RNA）转录：生物体以DNA的一条链为模板，按照碱基配对原则，在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下合成一条与DNA链的一定区段互补的RNA链，这个过程称为转录。编码链：与RNA序列相同的那条DNA链，又称正(+) 链、有意义链模板链：指导RNA合成的DNA链称，又称负(-)链 、反意义链不对称转录：在多基因的双链DNA分子中，每个基因的模板不是全在同一条链上，也就是在双链DNA分子中的一条链，对于某基因是有义链，但对另一个基因则可能是反义链。这就是我们所说的不对称转录，即模板链并非永远在同一条单链上。不对称转录。它有两方面含义：一是在DNA双链分子上，相对某基因来说，一股链可转录，另一股链不转录；其二是模板链并非永远在同一单链上几种类型的RNA：含量及作用1，信使RNA(mRNA)：它占全部RNA的5%左右。大肠杆菌中占总RNA的2%。2，转移RNA(tRNA)：tRNA在全部RNA中约占15%，种类在40种以上3，核糖体RNA(rRNA)： rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起形成核糖体。在大肠杆 菌中，rRNA占细胞总RNA的75%85% 。 除了上述3种主要的RNA外，还有一些类型的RNA 转录与DNA复制的异同 相同：模板，新链延伸方向，碱基的加入原则。相异：引物。信息全保留与信息半保留。底物、与T配对的碱基模板的数量（一条与两条）。所需要的酶，及酶的外切活性的有无。大肠杆菌RNA聚合酶的组成1，E. coli RNA聚合酶的核酶（ core enzyme ）：由2 组成作用：参与转录的全过程，但不能精确起始2. E. coli RNA聚合酶的全酶 (holoenzyme)：核酶因子因子负责模板链的选择与转录的起始。不仅能增加聚合酶对启动子的亲和力，还降低它对非专一位点的亲和力亚基功能（PPT）RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别(PPT)启动子（ Promoter ）：位于结构基因5，端上游的一段DNA序列，能被RNA聚合酶识别,结合并启动基因转录的一段DNA序列 转录起点：指RNA开始转录的第一个碱基，此点通常用+1表示上游（upstream）：转录起点的左侧，用负的数码表示 下游（downstream）：转录起点右侧（转录区），用正的数码表示 转录单元(transcription unit)：一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列.在细菌中，一个转录单元可以是一个基因，也可以是几个基因。 足迹法与启动子 启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。利用DNase 足迹法和DNA测序法可以确定启动子的序列结构。DNase 足迹法的基本原理与DNA 化学测序法有些相似. 首先将待测双链DNA 片段中一条单链的一端选择性地进行末端标记, 然后加入恰当浓度的DNase , 使在DNA 链上随机形成缺口, 经变性后电泳分离, 放射自显影, 即可形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA 条带. 但当DNA 片段与相应的序列特异性DNA 结合蛋白结合后, DNA 结合蛋白可保护相应的DNA 序列不受DNase 的攻击, 因而在放射自显影图谱上, DNA 梯度条带在相应于DNA 结合蛋白的结合区域中断, 从而形成一空白区域, 恰似蛋白质在DNA 上留下的足迹,因而被形象地称作足迹法. 如果同时进行DNA 化学测序, 即可判断出结合区的精确顺序. 原核启动子区的经典结构（PPT）原核启动子保守区的功能1， sextama box(-35区)：RNA聚合酶识别位点，该序列提供了RNA聚合酶识别的信号。 亚基识别-35序列，为转录选择模板。这一序列的核苷酸结构在很大程度上决定了启动子的强度。2，Pribnow box（-10区）： RNA聚合酶牢固结合位点，此处AT含量多，有助于DNA局部双链解开。是使起始复合物由关闭状态转变成启动状态的特定序列转录的基本过程1，启动子的识别2，转录起始3，RNA链的延伸4，终止启动子识别、转录的起始1.全酶与模板的DNA接触，生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动；2. 起始识别：全酶与35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物closed binary complex）；3.全酶紧密地结合在-10序列处，模板DNA局部变性，形成开放的启动子二元复合体；4. 酶移动到起点，第一和二个NTP相连,因子释放,形成酶-启动子-NTP三元复合体（ternary complex）。转录的延伸延伸的过程中，RNA聚合酶沿着转录泡（DNA双链解开而形成，约18碱基对）向前移动转录泡（transcription bubble）：在转录延长过程中，由局部打开的DNA双链、RNA聚合酶核心酶及新生成的RNA三者结合在一起的复合体，为空泡状结构，又称转录复合物。转录的终止1，不依赖于(rho)因子 的终止（强终止子）结构特点(1) 有富含GC的二重对称区；(2)茎的区域富内含G-C；(3) 强终止子3端上有poly(U) ，一般为6个强终止子终止转录的机制：l 发夹结构改变RNA聚合酶构象，使酶停止移动；l DNA、RNA各自形成自身双链使杂交体不稳定而分离；l 3端一连串U，UA配对最不稳定，易从模板上脱落。2，依赖于因子的终止依赖于因子的终止的特点：1，转录的RNA也具有发夹结构，但发夹结构后无poly(U)2,形成的发夹结构较疏松，茎环上不富含GC3，终止需要因子的参与4，与不依赖于因子的终止一样，终止信号存在于新生的RNA链上而非DNA链上过程（PPT）真核生物的转录和原核转录的不同点： (1) 原核只有一种RNA聚合酶，而真核细胞有三种聚合酶； (2) 启动子的结构特点不同，真核有三种不同的启动子和有关的元件； (3) 真核的转录有很多蛋白质因子的介入。真核生物启动子的基本结构: 核心启动子（TATAbox）、上游启动子元件(Gcbox、CAATbox)1，核心启动子：指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的，最少的DNA序列，包括转录起始位点及起始位点上游的TATA盒。核心启动子单独起作用时，只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录 起始位点： mRNA的第一个碱基倾向A TATA框： 其一致序列是T85A97T93A85A63A83A50， TATA框的作用： (1) 选择正确的转录起始位点，保证精确起始，故也称为选择子（selector）。 (2) 影响转录的速率。2，真核生物的上游启动子元件包括通常位于75 bp 附近的CAAT box（相当于原核启动子的sextama box）和GC box作用：控制转录起始的频率，基本不参与起始位点的确定原核生物mRNA的加工（PPT）真核mRNA前体的加工真核生物的mRNA转录后加工步骤：加帽 5端：m7GpppGpN 作用:稳定mRNA 5端和翻译的起始有关加尾 3端: polyA尾巴 作用：稳定mRNA和翻译模板活性有关mRNA前体的剪接剪除内含子，连接外显子加 帽帽子（甲基化的鸟苷酸）的类型,在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O型帽子,在次末端核苷酸的核糖上的2-0H位点上还有一个甲基位点的称1型帽子,此外，在第三个核苷酸的核糖上（2-0H）有甲基化位点的称2型帽子这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构帽子结构的功能：(1)有助于mRNA越过核膜，进入胞质；(2)保护5不被酶降解；(3)翻译时供IF（起始因子）和核糖体识别。加 尾过 程：1，特殊组分(CPSF)识别AAUAAA并指导其它的活性2，剪切因子(CF)在加尾位点 AAUAAA下游1130nt 处剪切RNA；3，末端腺苷转移酶poly(A)聚合酶合成poly(A)尾巴；4，PBP（poly A结合蛋白）与poly(A)结合，反应停止。尾巴的功能：1,PolyA是mRNA由核进入胞质所必需的形式。2,PolyA大大提高mRNA在胞质中的稳定性。 特异性剪接/选择性剪接选择性剪接：基因的初始转录物通过不同的剪接方式而实现的外显子的选择性使用。选择性剪接可以利用同一初级转录物得到不同的mRNA，翻译成不同的蛋白质。在人类基因中大约有的基因具有选择性剪接的形式选择性剪接的意义：1，选择性剪接极大地增加了蛋白质的多样性和基因表达的复杂程度2，性别决定与发育：选择性剪接可以调节决定性别及发育相关蛋白的表达3，许多疾病与mRNA前代选择性剪接有关RNA编辑RNA编辑（editing）是指转录后的RNA在编码区发生碱基的加入，丢失或转换等现象。它导致了DNA所编码的遗传信息的改变。形式：，单碱基突变，尿苷酸的缺失和添加原核生物和真核生物mRNA的不同（PPT）第四章 生物信息的传递（下）需要掌握的几个要点：1，翻译：以mRNA为模板，按照mRNA分子上的三个核苷酸决定一种氨基酸的规则（三联体密码）合成具有特定氨基酸顺序的蛋白质。包括翻译的起始、肽链的延伸、肽链的终止与释放。2，核糖体是蛋白质合成的场所，mRNA是蛋白质合成的模板，转移RNA（tRNA）是模板与氨基酸之间的接合体。 此外，在合成的各个阶段还有许多蛋白质、酶和其他生物大分子参与。实验证实三联子密码（遗传学证据）1、mRNA模板中插入、删除一个核苷酸后，该密码子后面的氨基酸序列全部改变。2、同时插入、删除一个不同核苷酸后，后续蛋白质不变。3、同时删除三个核苷酸后，翻译减少一个氨基酸，序列没有变化。 烟草花叶病毒外壳蛋白亚基由400个氨基酸组成，而相应的RNA片段长约1200个核苷酸实验破译三联子密码一，以均聚物、随机共聚物和特定序列的共聚物为模板指导多肽的合成二， 核糖体结合技术/三联体结合实验：核糖体结合技术的原理及实验操作遗传密码的性质一、遗传密码的简并性：简并的含义、什么叫同义密码子、密码子简并的生物学意义、一些常见的密码子（如起始密码子、终止密码子）二、密码子的普遍性与特殊性：含义三、密码子的变偶性：含义、摆动假说四、密码子无标点、不重叠tRNA(第二遗传密码)tRNA在蛋白质合成中处于关键地位，它不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送载体tRNA的三叶草型二级结构：五臂四环、各区的作用tRNA的三级结构：L型tRNA的功能：识别mRNA链上的密码子；转移氨基酸作用tRNA的分类无义突变校正与错义突变校正的概念、校正tRNA在怎么校正无义突变及错义突变核糖体核糖核蛋白的结构：l 由大小二亚基组成 l 给位（P位，肽位）： 起始时， tRNAimet结合于核糖体的肽位延长成肽后，肽链转到此位。l 受位（A位，氨基酰位）：延长成肽时，氨基酰tRNA就加入此位。核糖核蛋白的种类(胞质中)l 游离的核糖核蛋白-合成细胞固有蛋白 l 与粗面内质网结合的核糖核蛋白-合成带有信号肽的分泌性蛋白质原核与真核生物中核糖体的组成分别怎样？蛋白质合成的生物学机制1 氨基酸的活化与转运酶l 氨基酰tRNA合成酶l 绝对专一性 1个A.A1个氨基酰tRNA合成酶催化反应l 活化A.A-活化“-COOH”消耗2个ATPl 活化A.A+tRNA 氨基酰tRNA2 肽链合成的起始原核生物的起始tRNA是fMet-tRNAfMet，而真核生物是Met-tRNAiMet。原核生物中30S小亚基首先与mRNA模板相结合，再与fMet-tRNAfMet结合，最后与50S大亚基结合。而在真核生物中，40S小亚基首先与Met-tRNAMet相结合，再与模板mRNA结合，最后与60S大亚基结合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始复合物。起始复合物的生成除了需要GTP提供能量外，还需要Mg2+、NH4+及3个起始因子（IF-1、IF-2、IF-3）。 真核生物蛋白质生物合成的起始机制与原核生物基本相同，其差异主要是核糖体较大，有较多的起始因子参与，其mRNA具有m7GpppNp帽子结构，Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA分子5 端的“帽子”和3 端的多聚A都参与形成翻译起始复合物。 3 肽链的延伸生成起始复合物，第一个氨基酸（fMet/Met-tRNA）与核糖体结合以后，肽链开始伸长。按照mRNA模板密码子的排列，氨基酸通过新生肽键的方式被有序地结合上去。肽链延伸由许多循环组成，每加一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括AA-tRNA与核糖体结合、肽键的生成和移位、无负载的tRNA 的脱落。 掌握肽链延伸的具体过程1）后续AA-tRNA与核糖体结合（进位）2）肽键的生成(转肽)3）移位4）脱落4 肽链的终止 肽链的延伸过程中，当终止密码子UAA、UAG或UGA出现在核糖体的A位时，没有相应的AA-tRNA能与之结合，而释放因子能识别这些密码子并与之结合，水解P位上多肽链与tRNA之间的二酯键。接着，新生的肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体大、小亚基解体，蛋白质合成结束。释放因子RF具有GTP酶活性，它催化GTP水解，使肽链与核糖体解离。 细菌细胞内存在三种不同的终止因子（或称释放因子，RF1，RF2，RF3），RF1能识别UAG和UAA，RF2识别UGA和UAA。一旦RF与终止密码相结合，它们就能诱导肽基转移酶把一个水分子而不是氨基酸加到延伸中的肽链上。RF3可能与核糖体的解体有关。真核细胞只有一个（RF）终止因子。 蛋白质前体的加工新生的多肽链大多数是没有功能的，必须经过加工修饰才能转变为有活性的蛋白质。 1N端fMet或Met的切除2二硫键的形成3特定氨基酸的修饰4切除新生肽链中非功能片段4.4.6 蛋白质合成抑制剂 蛋白质生物合成的抑制剂主要是一些抗生素，如嘌呤霉素、链霉素、四环素、氯霉素、红霉素等，此外，如5-甲基色氨酸、环已亚胺、白喉毒素、蓖麻蛋白和其他核糖体灭活蛋白等都能抑制蛋白质的合成。链霉素是一种碱性三糖，能干扰fMet-tRNA与核糖体的结合，从而阻止蛋白质合成的正确起始，也会导致mRNA的错读。 嘌呤霉素是AA-tRNA的结构类似物，能结合在核糖体的A位上，抑制AA-tRNA的进入，嘌呤霉素是通过提前释放肽链来抑制蛋白质合成的 蛋白质运转机制一般说来，蛋白质运转可分为两大类：翻译运转同步机制:蛋白质的合成和运转同时发生的翻译后运转机制：蛋白质从核糖体上释放后才发生运转。分子生物学研究方法二、限制性核酸内切酶1.限制性核酸内切酶的概念：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。3.限制性核酸内切酶的分类根据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为、型三类。（PPT）4.型限制性核酸内切酶的功能型限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，识别序列一般为48个碱基对，具有迴文结构。它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端为P，3端为OH。限制性核酸内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口。 EcoR的识别序列：5- GAATTC-33- CTTAAG -55.II型限制性核酸内切酶酶切反应操作大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件： Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-100mmol/L DTT 1mmol/L Volume 20-100L Temperature Time 1-1.5h1个单位限制性核酸内切酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在50L反应液中反应1h，使1g标准DNA完全消化所需的酶量。.限制性核酸内切酶的星活性指由于反应条件改变，酶切的核酸序列不同于它特定的识别序列,即酶切反应的特异性发生了改变。星活性产生的原因如下： 反应体系中甘油的浓度大于5%。 酶用量过大，大于100U/微克DNA。 低离子强度，小于25mmol/L。 高pH，大于8.0。 含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙 酰胺等。 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在。常发生星活性的内切酶有：EcoRI、Hind、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。 5.2.2 DNA分子的连接（运用DNA连接酶进行连接）DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5-磷酸根和3-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要能量。大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。5.2.3 细菌转化细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致遗传性状特征发生改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。步骤：1.将快速生长中的大肠杆菌置于经低温（0）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球）。2.外源DNA粘附在细胞表面,形成复合物。 3.立即将该体系转移到42下做短暂的热刺激，复合物便会被细胞所吸收。4.在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达、细胞活性恢复 5. 涂布于选择性培养基中分离转化子。5.2.3 核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA片段的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的分子生物学研究方法。 一、基本原理一种带电分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率，它与电场强度、电泳分子本身所携带的净电荷数、分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关系 。在一般情况下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。2.4. PCR(聚合酶链式反应)及其应用概念：在引物指导下由酶催化的对特定DNA序列进行的体外扩增反应。由多个循环组成。每个循环包括了变性、退火以及延伸三个阶段。能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍PCR反应体系标准的PCR反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/LPCR中应注意的事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照： 阳性模板阴性对照： 阴性模板试剂对照： 除模板外的所有组分5.3 基因克隆技术基因克隆（分子克隆molecular cloning）-通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体,并导入受体细胞，进行永久保存和复制的过程。具体流程（一）目的基因的获取（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接（四）重组DNA导入受体菌（五）重组体的筛选分子克隆载体总述、载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力为外源基因的扩增提供必要的条件、载体特点至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞酵母双杂交系统的基本原理酵母双杂交系统巧妙地利用了真核生物转录调控因子的组件式结构（modular）特征，酵母转录因子GAL4 的DNA结合结构域BD 和转录激活结构域AD是转录激活因子发挥功能所必须的。只有当他们在空间上接近时才能行使激活转录的功能。将编码待测蛋白的基因分别与编码BD及编码AD基因构成融合基因，并导入酵母细胞中。如果待测蛋白间存在相互作用，则转录因子GAL4发挥作用，促使报告基因表达；如果待测蛋白间不存在相互作用，则转录因子GAL4不能发挥作用，报告基因不表达。用途1）已知蛋白之间相互作用的检测：2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。5.4 核酸杂交技术（一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子经限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测DNA样品中的基因及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 （二）Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测RNA样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 5.5 RNA 干扰RNA干扰是与靶基因序列同源的双链RNA所诱导的一种特异性的转录后基因沉默现象。RNAi的基本原理RNAi具有特异性和高效性。是一个依赖ATP的过程，一种称为Dicer的核酸酶负责将dsRNA酶切转化为3端有23nt突出、长2123bp 的小分子双链RNA ，这种RNA称为小干扰RNA（siRNA）。siRNA形成之后，与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体(RISC)，此复合物通过碱基互补配对识别靶mRNA 并使其降解，从而导致特定基因沉默。基因组（genome）基因组（genome）一词系由德国汉堡大学H. Winkles 教授于1920年首创，从GENe和chromosOME组成。用于表示生物的全部基因和染色体组成的概念。基因组（genome）：生物所具有的携带遗传信息的遗传物质的总和。遗传图与物理图 遗传作图（Genetic mapping） 采用遗传学分析方法将基因或其它DNA顺序标定在染色体上构建连锁图。这一方法包括杂交实验，家系分析等。物理作图（Physical mapping） 采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组实际位置。常用的物理作图方法： 由于遗传图的以上局限，须用物理图对其进行验证，校正和补充。 限制性作图（Restriction mapping） 荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）作图 顺序标签位点（Sequence tagged site, STS）作图 各种作图法比较 限制性作图快速，可提供详细信息，但不适合大基因组。 荧光原位杂交操作困难，资料积累慢，一次实验定位的分子标记不超过3-4个。 绘制详细的物理图还须寻找更有效方法。序列标记位点（STS）作图 目前最有效的物理作图技术，也是能对大基因组作出最详尽图谱的技术。 序列标记位点(STS)是一段短的DNA序列，通常长度在100到500bp，易于识别，每个基因组仅一份拷贝 。 作图时，先获取来自完整基因组的DNA片段。使用PCR技术检验DNA片段中的STS。两个STS共存于同一片段的概率依赖于它们在基因组中的接近程度。据此可计算两个STS间的距离一个DNA序列要成为STS，须满足两个前提： 1）首先它的序列必须是己知的，以便于用PCR方法检测STS在不同DNA片段中存在与否。 2）第二个要求是STS必须在待研究的染色体上有惟一的定位。如果STS序列具有多个 定位点，那么作图数据将会模糊不清。因此要确保STS不包含重复DNA序列。最常见的来源是： 1）表达序列标签（EST）：是从cDNA克隆中获得的短序列。须来自单拷贝基因而非基因家族成员。 2）简单序列长度多态性： SSLP在作图中可被用作STS，具有多态性并已通过连锁分析定位，直接建立遗传图与物理图的联系。 3）随机基因组序列 可以通过对克隆的基因组DNA的随机小片段进行测序或在数据库中搜寻贮存序列获得STS。 第7章基因的表达与调控（上）原核基因表达调控模式7.1.1 基因表达调控的基本概念基因表达与基因表达调控、组成型表达和适应型表达、调节基因和结构基因、操纵子一、基因表达与基因表达调控概念基因表达（gene expression） ：细胞在生命过程中，把蕴藏在DNA中的遗传信息经过转录和翻译，转变成为蛋白质或功能RNA分子的过程称为基因表达。 围绕基因表达过程中发生的各种各样的调节方式都统称为基因表达调控。rRNA或tRNA的基因经转录和转录后加工产生成熟的rRNA或tRNA,也是rRNA或tRNA的基因表达，因为rRNA或tRNA就具有在蛋白质翻译方面的功能。 二、基因表达的方式：组成型表达及适应型表达、组成型表达(constitutive expression) ：指不大受环境变动而变化的一类基因表达。如聚合酶，聚合酶等代谢过程中十分必需的酶或蛋白质的表达。某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因(housekeeping gene)。管家基因无论表达水平高低，较少受到环境因素的影响。在基因表达研究中，常作为对照基因、适应型表达（adaptive expression)：指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。应环境条件变化基因表达水平增高或从无到有的现象称为诱导(induction)，这类基因被称为可诱导的基因(inducible gene)；相反，随环境条件变化而基因表达水平降低或变为不表达的现象称为阻遏(repression)，相应的基因被称为可阻遏的基因(repressible gene)。三、结构基因和调节基因结构基因（structural genes）：编码蛋白质或功能性RNA的任何基因。所编码的蛋白质主要是组成细胞和组织基本成分的结构蛋白、具有催化活性的酶和调节蛋白等。原核生物的结构基因一般成簇排列，真核生物独立存在。结构基因簇由单一启动子共同调控。调节基因（regulator genes）：参与其他基因表达调控的RNA或蛋白质的编码基因。 调节基因编码的调节物质通过与DNA上的特定位点结合控制转录是调控的关键。 调节物与DNA特定位点的相互作用能以正调控的方式（启动或增强基因表达活性）调节靶基因，也能以负调控的方式（关闭或降低基因表达活性）调节靶基因。操纵子：由操纵基因以及相邻的若干结构基因所组成的功能单位，其中结构基因的转录受操纵基因的控制。7.1.2原核基因调控的分类和主要特点一、原核生物的基因调控特点：（1）基因调控主要发生在转录水平上，形式主要是操纵子调控.（2）有时也从DNA水平对基因表达进行调控，实质是基因重排。（3）在原核生物中，也有控制翻译过程的调控机制。（4）原核生物转录的起始、延伸、终止和抗终止过程及翻译的起始、延伸和终止过程，每一步都在对基因的表达实行调控。 二、原核生物基因调控的分类1、根据调控机制的不同可分为：正转录调控和负转录调控两大类2、根据基因对某些能调节它们的小分子的应答，可分为可诱导调节和可阻遏调节两大类。1、正转录调控系统和负转录调控系统在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），起着阻止结构基因转录的作用。根据其作用特征又可分为负控诱导和负控阻遏二大类。在负控诱导系统中，阻遏蛋白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录；在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。阻遏蛋白作用的部位是操纵区l 在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator）,促进结构基因的转录。也可根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导系统和正控阻遏系统。l 在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态；l 在正控阻遏系统中，效应物分子（辅阻遏蛋物）的存在使激活蛋白处于非活性状态。7.1.4 细菌的应急反应细菌有时会碰到紧急状况，比如氨基酸饥饿时，就不是缺少二种氨基酸，而是氨基酸的全面匮乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌将会产生一个应急反应，包括生产各种RNA、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生物化学反应过程均被停止。实施这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp）。产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。关于ppGpp的作用原理还不大清。ppGpp与pppGpp的作用范围十分广泛，它们不是只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批，所以它们是超级调控因子。7.2 乳糖操纵子与负控诱导系统乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。乳糖操纵子同时受正性调节和负性调节。阻遏蛋白的负性调节：没有诱导物存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有诱导物存在时，诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。因此，乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。 lac操纵子的激活需要cAMPCRP（CAP）复合物。这种需要是独立的，与阻遏体系无关，转录必须有此复合物在的启动子区域。lac操纵子的功能是在这两个体系的共同作用下来实现的.： 阻遏物的负调控因子、 CAP的正调控因子4、lac操纵子的诱导剂乳糖并不与阻遏物相结合，真正的诱导物是乳糖的异构体-异构乳糖。 Lac操纵子的诱导物 (inducer)：异构乳糖（别乳糖）、半乳糖、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）非底物诱导物(gratuitous inducer)：既能诱导酶的产生而本身又不被分解的诱导物。葡萄糖对lac操纵子的影响 代谢物阻遏效应catabolite repression 葡萄糖效应：是指当葡萄糖和其它糖类一起作为细菌的碳源时葡萄糖总是优先被利用，葡萄糖的存在阻止了其它糖类的利用的现象。除葡萄糖外，阿拉伯糖、麦芽糖等在降解过程中均转化生成葡萄糖或糖酵解途径中的其他中间产物，所以，这些糖代谢中有关的酶都是由可诱导的操纵子控制的。只要有葡萄糖存在，这些操纵子就不表达，被称为降解物敏感型操纵子。降解物敏感型操纵子：包括代谢乳糖、阿拉伯糖及麦芽糖等的操纵子。7.3 色氨酸操纵子与负控阻遏系统1、色氨酸操纵子的结构：色氨酸操纵子中的结构基因区是由trpE、trpD、trpC、trpB、trpA基因构成，紧邻trpE基因的是启动子区（P）、操纵区（O）、前导区（L）和弱化子区（a）。色氨酸操纵子中编码辅阻遏蛋白的基因是trpR，距色氨酸基因簇很远 1、阻遏系统-粗调 ：色氨酸操纵子的效应物是色氨酸，当培养基中色氨酸含量较高时，它与辅阻遏蛋白结合后，结合到操纵区，阻止转录；当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏蛋白不结合色氨酸，从操纵区解离，色氨酸操纵子启动转录。这种调节相当于色氨酸操纵子的粗调开关 2、弱化作用-细调 ：在前导肽的第10位和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。通过前导肽基因的翻译来调节色氨酸操纵子转录的终止。因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对色氨酰-tRNA的浓度敏感。 前导肽的转录弱化作用1，当培养基中色氨酸的浓度很低时，负载有色氨酸的tRNA也就少，这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区，这时的前导区结构是2-3配对，所以转录可继续进行。2.当培养基中色氨酸浓度较高时，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在4区被转录之前就到达2区，使2-3区不能配对，3-4区自由配对形成一发夹终止子结构，转录被终止，trp操纵子被关闭。弱化子对基因活性的影响是通过影响前导序列mRNA的结构而起作用的。起调节作用的是某种氨基酰-tRNA的浓度。7.4 其他操纵子半乳糖操纵子结构结构基因：异构酶(galE)，半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galT) ，半乳糖激酶(galk)这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。gal操纵子的特点：它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录； 它有两个O区，一个在P区上游-67-53，另一个在结构基因galE内部。cAMP-CRP对从S1和S2起始的转录有不同的作用。S1起始的转录只有在无葡萄糖时进行，需要半乳糖、CRP和较高浓度的cAMP 。S2起始的转录葡萄糖存在时进行，高水平的cAMP - CRP反而抑制转录的起始。7.4.2 阿拉伯糖操纵子（arabinose operon)araB基因、araA基因和araD, 形成一个基因簇，简写为araBAD 。他们分别编码核酮糖激酶，L-阿拉伯糖异构酶，L-核酮糖-5磷酸-差向异构酶。共同负责阿拉伯糖的降解。三个基因的表达受到ara操纵子中araC基因产物AraC蛋白的调控。ara操纵子的调控有三个特点：第一，araC表达受到AraC的自动调控。第二，AraC既可充当阻遏物，也可作为激活剂。第三，AraC与CAP结合可充分诱导ara操纵子。SOS反应的机理：由 RecA 蛋白和 LexA 阻遏物的相互作用引起的。LexA阻遏物：是SOS DNA修复系统所有基因的阻遏物RecA蛋白：是SOS反应的最初的发动因子。 DNA受到损伤或复制受到抑制时，RecA蛋白被激活，表现出水解酶活性，分解LexA阻遏物。当RecA水解LexA阻遏物后，导致SOS体系（包括recA基因）高效表达，DNA得到修复7.4.5 多启动子调控的操纵子 IrRNA操纵子大肠杆菌rRNA操纵子（rrnE）上有两个启动子，P1和P2。P1是强启动子，营养充沛时，由P1起始的转录产物比由P2起始的转录产物高3-5倍。当营养匮乏时，P1的作用被抑制，但P2仍有功能。 随着PPGPP浓度的增加，P1逐渐关闭，P2仍有活性。第八章 基因的表达与调控 -真核基因表达调控一般规律真核生物基因调控，根据其性质可分为两大类：第一类是瞬时调控或称可逆性调控，它相当于原核细胞对环境条件变化所做出的反应，包括某种底物或激素水平升降及细胞周期不同阶段中酶活性和浓度的调节。第二类是发育调控或称不可逆调控，是真核基因调控的精髓部分，它决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。二、真核基因组的一般构造特点 一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在操纵子 DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有小部分裸露 高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。 真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。 基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。 真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。 许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程（maturation and splicing），才能顺利地翻译成蛋白质。 8.1.3 真核生物DNA水平上的基因表达调控一、染色质结构对转录的影响二、基因扩增三、基因重排四、基因变换五、基因的丢失一、染色质结构对转录的影响在细胞分裂间期的细胞核中，染色质的形态不均匀。根据其形态及染色特点可分为常染色质和异染色质两种类型。 常染色质：折叠疏松、凝缩程度低，处于伸展状态，碱性染料染色时着色浅。 异染色质：折叠压缩程度高，处于凝集状态，经碱性染料染色着色深。 真核基因的活跃转录是在常染色质上进行组蛋白、核小体对染色质结构的影响l 组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录，去除组蛋白基因又能够恢复转录l 转录活跃的区域也常缺乏核小体的结构 l 进行活跃基因转录的染色质区段常有H1组蛋白水平降低、H2A、H2B组蛋白二聚体不稳定性增加、组蛋白乙酰化（acetylation）和泛素化（obiquitination）、以及H3组蛋白巯基活化等现象，这些都是核小体不稳定或解体的因素。核小体的结构消除或改变，会使DNA结构由右旋变为左旋，导致结构基因暴露，促使转录因子与启动区结合，诱发转录。 8.1.4 DNA甲基化与基因活性的调控DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，可能存在于所有高等生物中。 DNA甲基化能关闭某些基因的活性，而去甲基化则诱导了基因的重新活化与表达。 DNA甲基化会导致某些区域DNA构象变化，影响DNA的稳定性和蛋白质与DNA的相互作用，进而控制基因的表达。