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微生物与寄生虫学实验指导目录实验一 微生物的形态学检测 （2学时） 实验二 理化因素对微生物的影响（2学时）实验三 肠道致病性细菌的分离与鉴定（4学时）实验四 抗酸染色（2学时）实验五 寄生虫学实验（2学时）微生物与寄生虫学实验序 言本实验在于使学生加深和巩固课堂内容，并在掌握系统理论知识的基础上，学习微生物与寄生虫学的基本操作技能，通过实验加强无菌概念，培养独立工作和分析问题的能力，为今后有关的疾病诊断与中医中药的科学研究工作打下良好的基础。本实验指导共包括五个试验项目，共计教学12学时，按教学计划及大纲要求供我院中医学专业、针灸推拿专业、骨伤学专业、护理学专业、中西医结合等专业学生使用。实 验 室 规 则 本门学科实验的对象大多是病原微生物，如果不慎发生意外，不仅自身可能遭致感染，并有可能将病原微生物传给他人。因此，进入实验室必须遵守以下规则： 1. 非实验必需物品，不准带进实验室。 2进入实验室必须穿工作服，按规定就座，保持肃静。3上实验课要严格遵守课堂纪律，不得高声谈笑及乱动物品，禁止吸烟和进食。 4 实验时听从老师指导，牢固树立无菌观点，严格遵守无菌操作规程，若发生菌液污染，损坏物品等事故，应立即报告老师及时处理。5实验中用过的染菌器材如吸管，试管和用过的玻片等应及时放人含有消毒液的容器内，不得放在桌上，也不可在水槽里冲洗。6爱护公物，节约使用实验材料；注意安全使用水、电、煤气。7实验完毕，按要求整理器材物品，打扫卫生。脱下工作服，消毒洗手后，离开实验室。8作业应在规定时间内完成，实验报告要求简洁扼要，字迹清楚，画图力求正确、客观。 实验一 微生物的形态学检测 一、实验目的1、掌握细菌的基本形态（球菌、杆菌、弧菌）。2、掌握革兰氏染色的操作方法。3、熟悉生物显微镜的使用，特别是油镜的使用和保护；4、熟悉革兰氏染色的原理。二、实验内容（一） 显微镜油镜的使用及保护1、原理：在一般微生物学实验中最常使用的是普通光学显微镜的油镜。油镜镜头透镜很小，进入镜筒的光线很少，使用时为了增加亮度，必须在标本玻片与油镜头之间，滴加香柏油，因为香柏油的折光率与载玻片相似，这样就可使通过聚光器进入载玻片的光线不会因折射而散失，几乎全部进入镜筒内，使视野明亮，物象清楚。2、材料与试剂 生物显微镜及香柏油、二甲苯、标本片等。 3、操作步骤（1） 坐姿：使用显微镜油镜时，必须坐端，镜体保持垂直位，不要使载物台倾斜，以免香柏油或悬液标本流出。（2）识别油镜头：油镜头上一般刻有“ X 100”， “Oil”，“HI”等标记。（3）对光：用低倍镜对光，检查染色标本时光线宜强，要抬高聚光器，放大光圈，取得最大亮度。（4）滴加香柏油：将标本放在载物台上固定好。滴加香柏油1滴，换油镜检查。（5）找焦点：将油镜移至中央对准标本，从侧面注视镜头，并缓慢转动粗螺旋，使物镜筒下降，直至镜头浸于香柏油中并几乎接触到标本为止。然后将视线移至目镜，一面观察一面向上慢慢转动粗螺旋，待看到模糊的物象时，即改用细螺旋，调节焦点以寻求清晰的物象。（6）清洁保养：镜检完毕，将镜筒升起，取出标本片，用镜纸将镜头上的油擦净。若油已干，可用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去油迹，再用擦镜纸揩去二甲苯。然后，将聚光镜降下，各物镜呈“八”字形，套好保护套。（二）细菌的革兰氏染色法1、原理 G+菌细胞壁结构致密（肽聚糖层厚），且脂质含量少，乙醇不易渗入脱色。G-菌细胞壁结构疏松（肽聚糖层薄），且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。G+菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；G-菌菌体内核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。G+菌等电点比G-菌低，在同一pH值条件下阳性菌比阴性菌所带负电荷要多，故与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合牢固，不易被乙醇脱色。2、材料 金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌培养液、接种环、酒精灯、革兰染色液（结晶紫、卢戈碘液、95乙醇、复红或沙黄染液）。3、操作步骤（1）标本片制备取干净载玻片l块，用玻璃铅笔划一个区域。接种环按无菌操作法挑取少许菌液于区域中涂成一薄层，接种环在火焰上烧灼灭菌。在室温下自然干燥。将玻片通过火焰3次固定标本，自然冷却。（2）染色初染：在固定好并已冷却的涂片标本上滴加结晶紫染液，要盖满菌膜。约1分钟后用细水流从玻片的一端把游离的染液洗去。媒染：滴加卢戈碘液数滴，作用l分钟后，轻轻水洗。脱色：在玻片上加95乙醇23滴，并轻轻转动玻片数秒钟，使玻片倾斜让乙醇流去，如此重复数次，直至流下的乙醇几乎无色或稍呈淡紫色，流水冲洗。复染：滴加稀释复红染液数滴，作用1分钟后流水冲洗。染色完毕，用吸水纸将标本片吸干，玻片上滴加香柏油，油镜观察。（3）结果判定：染成紫色者为革兰阳性（G）菌，染成红色者为革兰阴性（G-）菌。（三）细菌的基本形态（示教）油镜下观察：球菌（葡萄球菌）革兰染色片、杆菌（大肠杆菌）革兰染色片、弧菌（霍乱弧菌）革兰染色片，注意观察细菌的形态、大小、排列和染色。 三、作业 1、绘出示教镜下细菌的基本形态（注意标明菌名、形态、排列、染色性）。 2、革兰氏染色结果（1）、用红蓝铅绘制出镜下所见两种细菌的形态（注意大小、形态、排列和染色性）。（2）、叙述革兰氏染色的意义。四、思考题1、试比较革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁结构的特征？实验二 理化因素对微生物的影响一、实验目的1、掌握细菌常用的接种方法和在不同培养基上的生长现象，细菌的三种特殊结构。 2、熟悉常用人工培养基的种类，实验室常用消毒和灭菌设备的原理及使用方法。 3、了解常用人工培养基的制备方法、细菌在自然界和人体的分布特点。二、实验内容（）常用培养基的制备方法 1、原理：培养基是用人工方法制备而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养制品。培养基按其物理性状可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基三种。2、材料与方法：（1）肉汤培养基成分：新鲜绞碎牛肉50g（或牛肉膏0.5g），蛋白胨lg，氯化钠0.5g，蒸馏水100m1。方法：取新鲜牛肉50g去脂肪、筋膜，绞碎。加水100rnl，搅匀，置冰箱过夜，次日取出，煮沸半小时，用脱脂棉和纱布过滤，并补足水分至原来的量，即为牛肉浸液。再加人蛋白胨、氯化钠，加热使之完全溶解，调整pH值至7.67.8，煮沸10分钟，过滤，分装，高压灭菌后备用。（2）琼脂培养基固体培养基：在肉汤培养基中加人23%琼脂，融化后调整pH值至7.67.8，分装，高压灭菌，在室温下凝固即为固体培养基，有平板、斜面和琼脂高层等数种。半固体培养基：如果在肉汤培养基中加人的琼脂量为0.30.5，如上炮制，灭菌后取出直立冷却，即为半固体培养基。血液琼脂培养基：有些细菌营养要求比较高，在普通的琼脂培养基上不能很好生长，需用血液琼脂培养基进行培养。将预先制备好的普通固体培养基100ml加热融化，待冷却到50左右时，用无菌操作法加入810ml的脱纤维兔血或羊血，混匀后倒入无菌平皿或试管中，冷却后即为血平板或血琼脂斜面培养基。（二）细菌的培养技术（技术操作）1、材料：普通液体培养基、琼脂平板培养基、斜面培养基、半固体培养基、大肠埃希菌与葡萄球菌混合菌液、大肠埃希菌斜面培养物、酒精灯、接种环、恒温培养箱。2、操作步骤：细菌的接种方法因各种培养基的不同而异。常用的有以下几种方法：（1）液体培养基接种法 用灭菌接种环取细菌（链球菌、大肠埃希菌等）培养物少许。 按无菌操作法将沾有细菌的接种环在倾斜的接近液面的管壁上轻轻涂抹研匀，试管直立使沾附在管壁上的细菌混人液体即可。接种完毕将试管置37培养24小时，观察上述细菌在液体培养基中的生长状况。（2）平板划线接种法：本法要求通过划线将混杂的细菌在平板上分散开来，并在平板上长成菌落，以达到分离培养获得纯培养物的目的。具体的方法有两种：平行划线法：左手斜持平板底，右手持接种环。接种环在火焰上灭菌，冷却后，沾取菌种，先在平板的一端涂开，然后由此开始向下平行密集划线，约占平板的一半。将平板转180角，从平板的另一端开始平行密集划线，直至划满平板的剩余部分。置37温箱培养。分区划线法：右手将接种环按无菌操作法沾取少许培养物（金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等），左手拿平板略打开，将标本涂于平板表面的一侧边缘，运用腕力连续划线（要密但不要重叠，不要划破培养基），划线范围约占平板面积的14。将平板旋转约90，接种环经灭菌、冷却后，通过第一次划线区23次。再作同样划线又占平板面积约14。重复上述操作，划完整个平板。将平板放在37温箱内，1824小时后观察各区细菌生长情况，有无单个菌落，以及菌落的颜色、形态等。比较金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等的菌落特点。（3）半固体接种法：左手持半固体培养管，右手持接种针，火焰灭菌冷却后，挑取细菌（大肠埃希菌、痢疾杆菌等），垂直刺入半固体培养基中心，至近管底处，然后循原路退出。塞上硅胶塞，接种针重新灭菌。接种完毕，于37培养1824小时，观察细菌生长情况。比较大肠埃希菌和痢疾杆菌固体培养基中的生长情况。 （三）细菌生长现象（示教）观察金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌及痢疾志贺菌在各种培养基上的生长现象和特点。1、在液体培养基上生长情况（1）表面生长：液体清晰，细菌生长在液面形成菌膜。如枯草杆菌。（2）混浊生长：液体均匀混浊，或有少量沉淀。如大肠埃希菌。（3）沉淀生长：液体清晰，细菌生长在管底，形成沉淀。如链球菌。2、在固体培养基上的生长情况（1）菌落：将细菌划线接种在固体培养基上，经1824小时培养，由单个细菌繁殖成的肉眼可见的细菌集团。观察时要注意菌落的大小、形状、表面性状、边缘是否整齐、透明度、颜色等，可作为鉴别细菌的依据之一。3、在半固体培养基上的生长情况 有鞭毛的细菌，由于能运动，在半固体培养基内沿穿刺线弥漫性长，使穿刺线变的模糊不清，出现试管刷现象。无鞭毛的细菌，因为不能运动，接种后仍沿穿刺线生长，穿刺线与周围界限清楚。（四）微生物的分布检测（讲解并指导学生操作）1、空气中细菌的检查（采用沉降法） 取无菌普通平板1只，置一处，启盖约15分，再盖上，37培养24h，取出观察有无细菌生长。 2、皮肤表面、水中细菌、75%乙醇消毒试验检查（采用涂抹法） 在普通培养基上分区后，直接用手指在无菌平板表面轻轻涂按1处，之后用自来水洗手指在平板表面2处轻轻涂按，再用75%乙醇棉球擦拭手指后，手指在平板表面3处轻轻涂按，37培养24h后，取出观察有无细菌生长。3、咽喉部细菌检查 用无菌棉拭子在咽喉部涂抹后，涂在血平板上，37培养24h后观察结果。注意平板上菌落种类及是否溶血。4、紫外线杀菌试验用接种环沾取大肠杆菌在琼脂平板培养基表面来回密密涂满整个平板。打开平板盖，盖上中空纸片，使其半暴露于紫外线灯下30分钟，距离为2030Cm。盖上盖，置37温箱内培养24h，观察平板表面细菌生长的情况。5、药物敏感试验 （纸片法）（1）、材料：大肠杆菌培养液、普通琼脂培养基、干燥药物纸片。（2）、方法：将大肠杆菌培养物用接种环均匀涂布于普通平板表面，稍干，以无菌镊子吸取有定量抗生素的无菌滤纸片（直径6mm），平铺于上述已种细菌的平板表面，一个平板可以放34块含不同药物的滤纸片，然后，置37培养。次日观察结果，凡滤纸片周围有抑菌圈的说明药物对细菌的抑制作用，抑菌圈越大则药物对细菌的抑制作用越强。观察并测量抑菌圈的大小，比较各种药物对试验菌的抗菌作用（或菌株对药物的敏感性）。6、湿热灭菌法将菌种接种于两个相同的液体培养基内，其中一管放入沸水中约15分钟，与未经处理的一管共同放入恒温箱内培养24h。（五）示教1、细菌的特殊结构油镜下观察：肺炎链球菌荚膜染色片、变形杆菌鞭毛染色片、破伤风梭菌芽胞染色片。2、高压蒸气灭菌法（原理和使用注意事项）高压蒸气灭菌器是一种坚固密闭的蒸锅，锅盖上装有压力计、安全阀及排气孔等。锅盖密闭旋紧后由锅底加热，因蒸气不能外溢，可使锅内压力逐渐增高，从而提高了锅内水的沸点和蒸气的温度。由于高压蒸气的温度较高，放出潜热多，热力穿透能力较强，故其灭菌效能最好。凡能耐热和耐潮湿的物品如培养基、生理盐水、纱布、玻璃器材等都可以用此法灭菌。使用时应在加热后先打开排气阀，使灭菌器内冷空气完全排出，再关闭排气阀，待压力表显示升至所需压强（一般是102.97Kpa或1.05Kg/cm2）此时温度可达121.30C,维持1520分钟。停止加热后，等压力逐渐自行下降到零时，慢慢开放排气阀，消除余气，开盖取物。三、作业1、空气中细菌的检查（描述结果并分析结果）2、皮肤表面、水中细菌、75%乙醇消毒试验检查（描述结果并分析结果）3、咽喉部细菌检查（描述结果并分析结果）4、紫外线杀菌试验（描述结果并分析结果）5、药物敏感试验（描述结果并分析结果）6、湿热灭菌法（描述结果并分析结果）7、绘出示教镜下细菌的特殊结构（注意标明菌名、特殊结构、染色方法和放大倍数）。四、思考题1、何谓细菌的人工培养，根据培养基的性质和用途可将培养基分为几类？2、细菌在各种培养基上有什么生长现象？3、如何正确理解消毒、灭菌和无菌与防腐概念？4、常用的物理灭菌方法有哪些，哪种效果最好，为什么？ 实验三 肠道致病性细菌的分离与鉴定一、实验目的1、掌握肠道致病菌的分离鉴定程序；SS培养基及双糖管的原理、接种方法和结果判定。2、熟悉链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌及痢疾杆菌的形态染色特性。3、熟悉血浆凝固酶实验的原理、方法及结果判定。二、实验内容（一）、油镜下观察（示教）：链球菌革兰染色片、脑膜炎奈瑟氏菌革兰染色片、痢疾杆菌革兰染色片，注意观察细菌的形态、大小、排列和染色。 （二）、血浆凝固酶实验（示教）1、原理：致病性葡萄球菌可产生一种能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆凝固的酶类物质，称为血浆凝固酶。此菌株侵入机体后，产生的凝固酶使血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白，导致血浆凝固。在体外与含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆混合时，在试管内使血浆成凝固状态；在玻片上可见凝集的细菌呈颗粒状。试管现象是游离血浆凝固酶的作用，玻片现象是结合于菌体上的凝固酶的作用。以往临床上常以是否产生此酶作为鉴定葡萄球菌有无致病性的一个指标。2、材料：新鲜兔血浆、生理盐水、干净玻片、接种环、玻璃铅笔等。1、 操作步骤：取清洁玻片一块，用玻璃铅笔划为两区，取兔血浆分别加入两区内，每区一到两滴，然后烧灼接种环，冷却后取金黄色葡萄球菌菌苔一环，置第一区内，同法取表皮葡萄球菌混于第二区内，静止数分钟后观察结果。（五）、肠道菌的分离与鉴别（讲解并指导学生操作）1、肠道致病性细菌的分离鉴定程序：程序：粪便标本形态学筛选生化反应血清学反应判断结果标本的采集（采集要点）粪便标本应取蚕豆大小的一块送检，并注意选取有脓血或其他异常外观的部分送检。取标本时应注意粪便的颜色与外观，所留取的标本应放在洁净的不吸水的蜡盒或塑料盒内送检，千万不要用纸张包裹，因为粘液和细胞等成分会被纸张吸收和破坏，不能得到准确的结果。如是用于做粪便细菌培养用的标本，一定应使用实验室提供的消毒专用标本盒，以避免其他细菌混入的标本中。本实验该步骤省略，由实验室提供模拟的临床粪便标本，其中含有肠道致病菌与肠道非致病菌。形态学筛选（标本涂片、革兰氏染色及观察要点见实验一）生化反应：SS培养基选择培养致病菌（原理、接种方法及结果分析），双糖管鉴别（原理、接种方法及结果分析）血清学（免疫学检测）-玻片凝集试验鉴定（原理、方法）。 2、原理：SS琼脂平板SS琼脂平板是一种选择培养基，对大肠埃希菌有较强的抑制作用，对肠道病原性杆菌无抑制作用或抑制作用很弱。SS琼脂平板除含有营养物质外，还有柠檬酸钠、煌绿和胆盐。前二者对大肠埃希菌的生长有抑制作用，胆盐对沙门菌和痢疾杆菌的生长有促进作用，而且胆盐同柠檬酸钠合用时，能加强对大肠埃希菌的抑制作用。此外，还有乳糖和指示剂中性红，在酸性时呈红色，碱性时呈淡黄色。一般肠道致病菌不分解乳糖，所以菌落为淡黄色，大肠埃希菌能分解乳糖产生酸类，使指示剂变色，菌落呈红色。双糖含铁斜面培养基双糖含铁斜面培养基是一种高层斜面培养基，由两层组成。上层由蛋白胨水作基础营养成分，加人1的乳糖及硫酸亚铁制备的固体斜面培养基，以酚红作指示剂，碱性时呈红色，酸性时为黄色。如细菌能发酵乳糖产酸则培养基的颜色由红变黄。此外由于还含有硫酸亚铁，所以还可以观察细菌是否产生硫化氢，如产生硫化氢，则可与硫酸亚铁生成黑色的硫化亚铁沉淀。下层为含葡萄糖的蛋白胨水半固体培养基，以酚红作指示剂，可观察细菌的动力和发酵葡萄糖的能力。接种时用接种针挑取细菌，先由培养基的中央向下垂直穿刺到接近管底，然后沿原线退出，再划线于斜面上，放置37恒温箱培养l824小时后观察结果。结果判定：三种肠道杆菌在双糖含铁斜面培养基上的生化反应 斜面 中层 下层 乳糖 硫化氢 葡萄糖 动力大 大肠埃希菌 - +伤 （鼠）伤寒沙门菌 - + （）/+ +痢 痢疾志贺菌 - - + -注: 乳糖、葡萄糖一栏“”为产酸产气， “+”为产酸不产气，“-”为不分解。硫化氢、动力一栏“+”为产生硫化氢或有动力，“-”为不产生硫化氢或无动力。3、 示教肠道杆菌在SS培养基及双糖管上的生长现象。4、玻片凝集反应（直接凝集反应）1、原理：在适当的电解质环境中，颗粒性抗原（如细菌、细胞等）与相应抗体结合能形成肉眼可见的凝集块，即凝集反应。已知抗体（诊断血清）与未知抗原（待检细菌）在玻片上的直接凝集常用于细菌的鉴定与分型。2、材料：脱脂玻片、生理盐水、接种环、肠道菌抗血清。3、方法：取洁净玻片，将肠道菌诊断血清滴在玻片上l2滴。用接种环取粪便标本少许，分别与上述的诊断血清混匀成乳浊状态。轻轻摇动玻片，经12分钟出现乳白色凝集颗粒，即为阳性反应，阴性的仍为乳浊状态。三、作业1、绘图：示教镜下的链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、痢疾杆菌（注意标明菌名、染色方法、排列方式和放大倍数）。2、血浆凝固酶试验（描述结果并分析结果）3、肠道致病菌的分离与鉴别（记录鉴定结果及鉴定的步骤）四、思考题1、根据生化特性及产生的色素，葡萄球菌可分为那几种类型？2、肠道杆菌具有那些共同的生物学特性？3、用什么方法可以鉴定肠道致病菌？实验四 抗酸染色一、实验目的1、掌握抗酸染色的基本程序。2、熟悉破伤风梭菌的芽胞、白喉杆菌的异染颗粒、结核分枝杆菌的形态及染色性。二、实验内容（一）、观察破伤风梭菌、白喉杆菌、结核杆菌的形态、染色性。注意观察破伤风梭菌芽胞的大小和位置；白喉杆菌的排列和异染颗粒；（二）、结核分枝杆菌的抗酸染色法（技术操作）1、原理：结核分枝杆菌对苯胺染料一般不易着色，但若加温或者延长染色时间使其着色后则再用3盐酸乙醇处理也不易脱色。经此染色后，结核分枝杆菌呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。2、材料：卡介苗与大肠杆菌的混合菌液、抗酸染液（石碳酸复红染液、3盐酸乙醇、1美蓝）、玻片、试管夹、酒精灯、滤纸片、接种环等。3、操作步骤：接种环挑取混合菌夜，制成涂片。自然干燥后用火焰固定。将石碳酸复红染液滴加在涂片上。在酒精灯上微微加热，至有热气冒出，但不可沸腾。随时添加染液，不使其烧干，维持35min。倾去染液，待玻片冷却后用水洗去多余的染液。用3盐酸乙醇脱色，直至流下的乙醇呈微红色为止，水洗。用1美蓝复染半分钟至一分钟，水洗。将玻片上的水吸干，镜检。观察结核分枝杆菌的染色和形态。4、结果判定： 结核分枝杆菌被染成红色，菌体细长呈杆状或略带弯曲，有分枝生长趋势。三、作业1、绘制出镜下观察到的白喉杆菌的异染颗粒。2、用红蓝铅绘制出镜下所见抗酸染色后的结核杆菌及大肠杆菌的形态（注意大小、排列和染色）。 四、思考题 1、试述结核杆菌的染色特性及培养特性？2、试述抗酸染色的原理、基本步骤及结果？实验五 寄生虫线虫实验一、实验目的1、掌握常见线虫虫卵的形态特征；掌握链状带绦虫、肥胖带绦虫成虫形态；链状带绦虫和肥胖带绦虫的形态鉴别要点。2、熟悉各种线虫的成虫形态特征和寄生部位。常见吸虫的成虫及吸虫纲寄生虫的中间宿主；熟悉带绦虫卵、猪囊尾蚴和棘球蚴的特征；二、实验内容（一）、示教：1、成虫标本：蛔虫、钩虫、蛲虫、丝虫、鞭虫、肝吸虫、姜片吸虫、肺吸虫、日本血吸虫及中间宿主。 链状带绦虫、肥胖带绦虫、米猪肉及棘球蚴。2、玻片标本：蛔虫受精卵