免疫与血清学基本技术

第七章免疫与血清学基本技术第一节免疫学基本知识一、抗原抗原是指能与T细胞及B细胞的受体结合，促使其增殖、分化，产生抗体或致敏淋巴细胞，并与之结合，进而发挥免疫效应的物质。抗原一般具有两个重要特性：一是免疫原性，即抗原刺激机体产生免疫应答，诱生抗体或致敏淋巴细胞的能力；二是抗原性，即抗原与其诱生的抗体或致敏淋巴细胞有特异性结合的能力。既有免疫源性又有抗原性的物质为完全抗原，而只有抗原性无免疫源性的物质称为半抗原。决定Ag特异性的最小化学亚单位称为决定簇（又称表位）。依其与胸腺关系又分胸腺依赖抗原（TD-Ag）和胸腺非依赖抗原（TI-Ag）。绝大多数蛋白质抗原如病原微生物、血细胞、血清蛋白等均属于TD-Ag。抗原的免疫源性是异物性，抗原的特异性是免疫应答中最重要的特点，也是免疫学诊断和免疫学防治的理论依据。人类血型抗原有A和B抗原，它们刺激机体产生抗A和抗B抗体。人类血型抗原是同种异型抗原（同一种属不同个体间的遗传标记不同）。器官移植所产生的排异反应，也是因同种异型抗原所致。佐剂在免疫中常常采用，它主要的机制是增强机体对Ag的免疫应答。二、抗体抗体是抗原刺激机体由B细胞产生的，本质是免疫球蛋白（Ig）。Ig的基本结构是：4条肽链（2条轻链-L链、2条重链-H链）由二硫键连接。L链分为可变部位（V）和恒定部分（C），即VL+CL。H链也分为可变部位（V）和恒定部分（C），即VH+CH，但CH部分又分为CH1、CH2、CH3。IgM和IgE还有CH4部分。CH1与CH2区之间为绞链区。如果用木瓜酶水解后，将IgG水解2Fab和Fc。Fab是Ig与Ag结合部位，Fc是可结晶部分。用胃蛋白酶水解IgG，可分为F(ab)2和Fc部分，F(ab)2是两个Fab连在一起的部分。Ig的分类是依据H链的结构特点，主要依Fc部分（CH）。Ig分为五大类：IgG、IgM、IgA、IgE、IgD。Ig同种型是指H链所具有的的特性。同一类Ig分型依据L链结构特点，可分为和型。Ig的Fc段部分可与某些细胞的Fc受体结合，如巨噬细胞等。F(ab)2部分是与Ag结合部，VH+VL是F(ab)2中的高变区，直接与Ag能结合的部位。人类5种Ig各具特色，IgM分子量最大，免疫应答早期产生的Ab只要为IgM。IgG在血清中含量最高，而且是唯一能通过人类胎盘的Ig。IgA经J链连接，可形成多聚IgA。多聚IgA与分泌片结合后，能抵抗蛋白酶的水解作用。有人称具备局部Ab。IgE可与肥大细胞膜上Fc受体结合。三、抗原抗体反应每一种抗原物质都能在具有免疫功能的机体中遇到与其相应的免疫细胞，结合在其表面受体上，激发产生相应的抗体，并且能够与这种抗体特异性地结合。抗原与抗体的结合为非共价结合。其分子空间结构的互补性，决定了结合部位原子间的接近程度，使各种弱作用键充分发挥作用，形成相对稳定的结合。在机体内，抗原和抗体的结合导致补体激活，最终引起杀细胞或杀菌作用；或者结合于吞噬细胞表面的受体，引起对细菌或异物的吞噬作用。抗原与抗体的结合使特异性的，这种性质构成了各种免疫学测定的基础；同时，这种结合反应只是相对稳固的，可以利用洗脱的方法将它们重新分离而不损害其活性，这种方法可以用于抗原或抗体的提纯。四、补体（C）存在于人和动物血清中，不耐热，可辅助特异性抗体介导的溶菌作用，由于这种成分是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，这种物质称为补体。补体由9种成分，11种蛋白组成：C1（q、r、s）、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9。它们对温度很敏感，易被破坏。补体系统包括补体及D、P、B等因子，约有20种成分。补体激活有两个途径：传统途径（第一途径）和旁路途径（第二途径）。第一途径可被Ag-Ab免疫复合物（IC）活化。活化顺序是：C1、C4、C2、C3、C5、C6、C7、C8、C9。第二途径可被细菌的脂多糖激活。补体的激活是一种酶促级连反应：第一种成分激活后，称为一种有活性的酶，催化下一种成分转化为具有生物活性的物质（蛋白酶或炎症诱导成分）。补体的最后3种成分将聚合成为“终末复合物”，其本身或在抗体的帮助下插入细菌外膜，导致细菌死亡。五、免疫系统1、免疫组织器官（1）中苏免疫器官：骨髓、胸腺、法氏囊（禽类）（2）周围免疫器官：脾脏、淋巴结、皮肤免疫系统、黏膜免疫系统。2、免疫细胞干细胞、淋巴细胞系（TH、TC、TS、TDH、BC浆细胞等）、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、NK细胞等。单核细胞及巨噬细胞产生IL-1。3、免疫分子TCR、BCR、CD、MHC、Ig、补体、细胞因子（IL-1、IL-2）六、各免疫细胞特点1、T细胞可分为几群，其中TH细胞是很重要的免疫细胞，CD4+可被PHA、ConA、PWM、花生凝集素刺激活化进行有丝分裂，帮助产生抗体，司管细胞免疫。TS细胞是抑制细胞，CD8+参加免疫调节。TC是细胞毒细胞。TH细胞成熟需要胸腺加工处理。T细胞定位于淋巴结副皮质区。2、B细胞B淋巴细胞主管体液免疫调节。表面有抗原受体（SMIg）。BC成熟在骨髓中（相当禽类法氏囊）。未成熟BC最初可查到Ig的链，活化BC可衍变成浆细胞，浆细胞能产生Ab和分泌Ab。PWM可以刺激BC有丝分裂。人类外周血中T细胞与B细胞比为2：1。3、单核类细胞无Ag受体，但不能处理Ag，加工Ag，并向T细胞呈递Ag。七、过敏反应（变态反应）国际公认的过敏反应是4个型：型（速发型）、型（溶细胞型）、型（免疫复合物型或称血管炎型）、型（迟发型）。第型是由IgE抗体所致，IgE与肥大细胞的IgE的Fc受体结合产生一系列变化，出现型过敏。如青霉素过敏（皮内注射过敏原）。患有慢性寄生虫感染疾患；IgE抗体升高显著。第型过敏反应是由T细胞中TDH细胞释放淋巴因子所致。如结核菌素过敏试验（皮内直射过敏原）第型、型过敏系由IgM、IgG抗体及补体参与介导。第二节抗体检测一、抗体检测的基本原理抗原与抗体之间特异性的结合反应，是免疫学检测的基础，既抗原使用已知抗原来检测抗体，也可以使用一直抗体来检测抗原。抗原与抗体虽然都是大分子物质，但单分子的抗原与抗体反应仍然是肉眼无法觉察的反应。要检测抗体的存在，就必须建立一中显示系统，将看不见的抗原-抗体反应，转化为抗原看见、或者可以测定的反应。抗体测定抗原使用许多种不同的方法，本质上浙西而方法只有显示系统的误差。不同的方法可以显示出不同量的抗原-抗体反应，因而，抗体检测的方法主要决定了抗体检测的灵敏度。检测抗体必须使用已知的抗原，抗原可能是混杂的物质。因而，在抗体测定中使用的抗原种类，主要决定了抗体检测的特异性。二、抗体检测方法(一）中和反应中和反应不仅测定抗体是否存在，而且测定抗体是否具有免疫保护作用，因而，尽管这种方法复杂、费时，影响因素众多而且不稳定，在预防医学领域特别是病毒性疾病中，仍然是不可区带的抗体检测方法。中和试验的基本方法是，将待检物质与活的致病微生物混合，感染实验动物或敏感的细胞，然后观察实验动物是否发病、死亡、或细胞是否发生病变。早期中和试验主要利用疾病的动物模型进行，目前，在病毒性疾病领域，通常利用培养病毒的细胞进行。在结果的解释中应当注意，细胞的中和试验通常只反映抗体阻断病毒进入细胞的能力，这只是病毒致病过程中的一小部分。（二）沉淀反应血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合出现沉淀物，这类反应称为沉淀反应。该类反应可检测到202mg/mL水平的抗体。较常用的检测方法有：1、单项免疫扩散将一定量抑制抗原混于琼脂中制成琼脂板，在适当位置打孔后将抗体加入孔中扩散，抗原抗体在扩散过程形成以抗体孔为中心的沉淀环，可用于检测血清中的IgG、IgM、IgA和补体C3等含量。2、双相免疫扩散将抗原与抗体分别加于琼脂凝胶中，二者自由向四周扩散，在相遇处形成沉淀线。可用于抗体的定性、定量检测。（三）凝集反应细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块，这一类反应称为凝集反应，该类反应可检测到1g/mL。1、直接凝集将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌或红细胞凝集现象。检测方法有两种：是玻片凝集试验，用于定性测抗原，多用于快速诊断；是试管凝集试验，在试管种系列稀释待检血清，加入已知颗粒抗原（死菌或活菌，多用死菌），进行的血清反应，用于定量检测抗体。温箱中放24小时后取出反应管在室温放2个小时再判断为宜，判定凝集滴度以凝集程度为+而定。2、间接凝集将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集的现象。如用球蛋白包被的乳胶颗粒，检测病人血清中的一种抗球蛋白的抗体（类风湿因子）（四）补体参加的反应利用抗体与红细胞上的抗原结合，激活反应体系中的补体，导致红细胞的溶解，用溶血现象作为指示系统帮助结果判定。常用的方法有补体结合试验和溶血空斑试验。（五）用标记抗原进行的抗原抗体反应利用荧光素、酶或放射性核素等标记物标记抗原或抗体，进行的抗原抗体反应。灵敏度高、快速，可定性或定量，甚至定位等优点。1、免疫荧光将已知细菌、感染病毒的细胞等颗粒抗原等固定于载玻片，加待检血清反应后，再加荧光素标记的抗体，置荧光显微镜下观察判定，用于检测抗体。2、酶免疫测定是用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。可用目测定性，也可用酶标测定仪测定光密度（OD）值以反映抗体的含量，敏感度可达ng/mL甚至pg/mL。常用语标记的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。常用的方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）。或采用双抗体夹心法或间接法检测特异抗体。3、放射免疫测定法用放射性的核素（125I和131I）标记抗原，检测抗体，灵敏度达pg/mL。4、免疫印迹法将凝胶电泳与固相免疫结合，把电泳区分的蛋白质抗原转移至NC或PVDF等膜上。检测特异的抗体。用该法检测血清HIV抗体为诊断HIV感染的方法之一。三、抗体检测所使用的抗原病原微生物，无论是细菌还是病毒，都含有许多种抗原物质，在感染过程中，会形成反应性非常复杂的抗体。这些抗原的特异性很不相同，有的只存在于该种致病微生物中，也有的可能是在细菌或病毒中广泛存在时，甚至可以和动物以至人体的组织产生交叉反应。因此，我们在衡量一项抗体检测的结果时，不仅需要考虑所采用的方法和滴度的高低，还必须考虑用于检测的是那一种类型的抗原。1、全菌或全病毒抗原最早的血清学反应，就是将细菌或病毒直接杀死后作为抗原进行的。目前，这种类型的抗原在一些疾病，几种类型的试验方法如细菌凝集试验或免疫荧光检测中仍在应用。由于这种类型的抗原物质中成分复杂，很难避免交叉反应，在用作疾病诊断时，必须结合临床症状并对结果判定有较严格的限制。由于结果难于解释，这些方法很难用于大规模的疾病监测。2、替代抗原由于一些种类的微生物只能在细胞中生长，无法获得纯培养，传统上使用与它们具有交叉反应的抗原物质来测定这些疾病产生的抗体。如诊断立克次体病使用的变形杆菌抗原或诊断梅毒的牛心脂抗原。由于这些抗原广泛存在，这种检测方法的结果只能具有参考价值。3、粗提取抗原在一些监测方法发展较早的疾病中，已经选用了病原微生物中高度特异的抗原成分，而在监测方法中使用的抗原物质，也已经过了一定程度的提纯，但其中仍会含有少量的其他杂散蛋白质。在当前使用的高灵敏度检测方法中，极微量的蛋白质也能显示反应。这说明，使用这种类型抗原的试验，虽然对结果能有明确的解释，但仍然存在着交叉反应的可能性。4、精提纯抗原当前，已经有一些疾病的抗体检测中，使用高度提纯的抗原。可能是天然的，也可能是克隆的蛋白质，能够达到“层析纯”的纯度，即经过电泳只能见到清晰的单一蛋白质条带。使用这样的抗原物质进行的检测，可以得到最可靠的结果。然而，这仍然不能保证不同微生物之间具有共同抗原的可能性。使用分子克隆方法获取的蛋白质，不能认为就已经是精提纯的抗原。因为任何克隆都必须在载体中表达，不管表达的蛋白质量有多大，其中还是会含有受体细胞或表达系统中成分，这些成分仍然能够引起交叉反应。还有一些疾病，抗原的特异性本身就不够明确，目前仍然需要通过蛋白印迹试验，不是通过明确的蛋白质种类，而是根据多种不明性质的蛋白质组成的图形来确定诊断。在这样的疾病，即使高度提纯的抗原物质也难于在监测中应用。四、抗体本地测定无论发展得多么成熟的检测方法，也无论提取得多么纯粹的抗原，在大规模的疾病监测中，还是会在无疾病的人群或动物中显示一定程度的反应，这称为抗体本底，诶一种新的方法投入使用前，都必须进行抗体本底测定。本底抗体可能有以下几个主要的来源：1、杂散抗原致病微生物通常具有复杂的抗原结构，其中许多是低特异性的，存在于许多微生物，甚至宿主机体之中。这些杂散抗原能产生低滴度的抗体。因而在根本没有疾病流行的人群或动物中，本底抗体反映着其他类型的感染，甚至其他未知来源产生的抗体。2、共同抗原现代分子生物学表明，任何一个基因都是可能转移的，多为的病原微生物，都是由于基因的转移，从其非致病的祖先转化而来。尽管在检测中采用了高度特异并且高度提纯的抗原，这种抗原仍然可能存在着目前未知的其他来源。这种来源的抗原，有时可以在无疾病个体中产生高滴度的抗体。3、既往感染并非所有的本底抗体反应都源自非特异性，个体在感染后，抗体可能保持相当长的时间，疾病在动物间的存在常常不被人所发掘，人类的感染也可能由于症状轻微或时间久远而无从追溯，于是，这些疾病过程所产生的抗体便成了本底抗体。进行本底调查需要在一个已经确认没有疾病流行的地区，采取一定数量的“健康个体”血清标本，测定其中的抗体，并计算反应的几何平均抗体滴度。抗体本底测定最主要的目标，是建立疾病的安定标准。这需要积累一定数量的，经过病原学确诊的个体，测定病后不同时间的抗体水平，再与本底抗体水平相比较，运用数理统计方法确定期间的判别值。只有这样，抗体测定的方法才能够在疾病诊断和监测中实际应用。第三节细胞免疫检查一、淋巴细胞的分离与类型鉴定体外检测淋巴细胞，需要先制备外周血单个核细胞（PBMC），制备PBMC常用的方法是葡聚糖-泛影葡胺（淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。以下方法通过检测淋巴细胞的某些表面标志，可确定细胞的不同类型。1、免疫荧光法常用直接或间接免疫荧光法检查淋巴细胞的表面标志，鉴定细胞的群、亚群。如CD4+和CD8+细胞亚群，表达mIgD、mIgM的B细胞亚群。2、磁珠分离法将已知抗细胞表面标记的抗体交联到磁珠颗粒，与细胞悬液反应后，磁珠通过抗体结合相应的细胞群或亚群表面，借助磁场，将磁珠结合的细胞与未结合的细胞分开。3、淘选法将一直抗细胞表面标记的抗体包被培养皿，加淋巴细胞悬液，表达响应表面标记的细胞即与相应抗体结合，而黏附于固相上，与悬液中的其他细胞分开。4、流式细胞术使用流式细胞仪进行分离，借助荧光激活细胞分选器（FACS）对免疫细胞及其他细胞进行快速准确鉴定和分类技术。二、免疫细胞功能测定（一）T细胞功能测定1、T细胞增殖试验采用3H-TdR掺入法检测。在PBMC中加入植物血凝素（PHA）共同培养，终止培养前815小时加入3H-TdR，由于3H-TdR能掺入细胞合成的DNA中，细胞增殖的水平越高，掺入的放射性核素越高。用液体闪烁仪检测细胞样品中的放射活性，测定细胞的增值情况。2、细胞毒试验（1）51Cr释放法：用Na2CrO4标记靶细胞，若待检效应细胞能杀伤靶细胞，测51Cr从靶细胞内释放，用计数仪测定释放的51Cr放射活性，靶细胞溶解破坏越多，51Cr释放越多，上清液中的放射活性越低。（2）乳酸脱氢酶释放法：将效应细胞与靶细胞按比例混合，靶细胞被杀伤后细胞膜受损，释放出乳酸脱氢酶，用光度计测定溶液中的该酶的含量，反映效应细胞的杀伤活性。（3）皮肤试验：根据局部红肿为特征的迟发型超敏反应的强度检测。常用的生物性抗原常从病原体中提取，如结核菌素、麻风菌素等。（二）B细胞功能测定1、B细胞增殖试验B细胞受丝裂原刺激后，进行分裂增殖，温育一定时间后检查抗体形成细胞的数目。2、抗体形成细胞测定常用溶血空斑试验测定。将SRBC、待检B细胞、补体及适量琼脂糖液混合，倾斜平皿，温育13小时后，肉眼观测分散的溶血空斑出现，每一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑的数量即为抗体形成细胞数。三、免疫细胞因子测定细胞因子的检测有助于了解其在免疫调节中的作用，鉴定分离的淋巴细胞，监测某些疾病状态的细胞免疫功能。1、免疫学检测法用细胞因子单克隆抗体包被固相的双抗体夹心法或酶联免疫斑点试验（ELISPOT）测定法。也可用荧光素标记抗细胞因子抗体，对细胞内细胞因子作染色，直接用FACS分析法测定产生该细胞因子的细胞比例。2、RT-PCR法设计特定引物，逆转录特定细胞因子的mRNA，然后用特定引物进行PCR扩增，进行定性、定量检测。第四节抗原检测一、抗原检测的目的1、疾病的快速诊断由人或动物的组织、器官或其他标本中检出病原微生物特征性的抗原成分，可以对某些疾病作出早期诊断。2、病原微生物鉴定分离获得病原微生物后，可以通过抗原检测确定其血清型，或者通过针对致病决定因子的抗原检测确定其致病性。3、生物活性物质的抗原分析提取的或人工合成的生物活性物质，如果具有抗原性，都可以利用抗原检测的方法确定其生物活性。二、抗原的检测方法在“抗体检测”一节中介绍的方法，都可以通过相反方向的运用，即使用已知抗体，通过类似的方法来进行抗原检测。三、单克隆抗体的应用与抗体检测方法类似，用于检测的抗体，决定了抗原检测的特异性。单克隆抗体的出现，使抗原测定称为精确的免疫学方法。一种B淋巴细胞抗原刺激后只能产生一种抗体，因此称其为单克隆抗体。使用细胞杂交技术，使免疫的小鼠脾细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，产生的杂交瘤细胞株可以在体外条件下任意增殖，并产生专一的，融合的B淋巴细胞特异的抗体，从而使单克隆抗体成为一种实用的技术。单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。单克隆抗体用于抗原检测时能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原-抗体反应的特异性，减少了和其他物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原-抗体反应结果便于控制。这些检测方法可用于诊断各种疾病，检测肿瘤特异性抗原和肿