肌肉生长发育的表观调控.doc

肌肉生长发育的表观调控摘 要:肌肉生长发育是一个复杂的过程，涉及到大量基因的表达与调控。如，HMGCS1、MSTN、MyoD、Myf6等基因都对肌纤维的生长发育有关，除此之外，还有许多其它参与肌肉生长发育调控的基因尚未被发现。肌肉细胞增殖、分化受一些正向调控因子和负向调控因子的双向调节。本文将对，现已知与肌肉生长发育相关的部分基因对肌肉生长发育的调控机理进行述。关键词:肌肉发育； MyoD；Myf6；MSTNMuscle growth and development of apparent regulationAbstract:Muscle growth and development is a complex process that involves a large amount of gene expression and regulation. Such as HMGCS1, MSTN, MyoD, Myf6 genes are all associated with the growth and development of muscle fibers. In addition, there are many other involved in muscle growth and development regulation of the gene has not yet been found. Muscle cell proliferation and differentiation is bidirectional regulated by the some positive factors and negative regulation factors . This article will tell the known genes associated with muscle growth and development on the regulation mechanism of muscle growth and development.Key words:Muscle development ；MyoD；Myf6；MSTN1 前言动物肌肉主要由肌束组成，肌束又由肌纤维和一些相关蛋白及脂肪等组成。同时，动物肌肉的生长发育也有一定的规律：出生前和出生后平滑肌生长主要靠细胞增殖，细胞肥大的能力有限；哺乳动物出生前心脏生长主要靠细胞增殖,但出生后主要靠细胞肥大,没有新的细胞形成；成肌细胞在出生前后均可以分裂增殖，但一旦融合形成肌管和肌纤维，即失去增殖能力，出生后骨骼肌的生长只能靠预先形成的肌纤维的肥大。因此，任何能对动物肌肉组成成分的生成和生长发育规律产生影响的基因，都会对肌肉的生长发育进行调控。例如，myf6、MyoD、FoxO1、MSTN、HMGCS1等基因，都会直接或间接对肌肉的生长发育进行正向或负向调控。2 基因对肌肉生长的正向调控作用及其作用机制肌肉细胞分化、生长都受基因的调控影响，随着生物技术的发展，MyoD基因家族、HMGCS1、IGFs等促进肌肉生长的基因也相继被发现。这些基因对肌细胞的形成和增殖分化都起到了不同的促进作用，对这些基因的作用机制进行研究对于了解动物肌肉的生长发育具有重大意义。2.1 myf6基因对肌肉生长发育的调控myf6是生肌调节因子MRFs（Myogenic regulatory factors）家族的成员之一，可与普遍表达的 E2A 基因产物 E12、E47 等产生相互作用，通过反式激活作用，促进肌特异基因如肌球蛋白、肌肉肌酸激酶（Muscle creatine kinase，MCK）、乙酰胆碱受体等基因的表达，激发生肌作用1。有人通过对牛的myf6基因进行克隆，然后用重组质粒 pIRES2-EGFP-myf6 对牛成纤维细胞进行转染发现，对成纤维细胞进行myf6基因转染，可检测到成纤维细胞中myf6蛋白和 mRNA表达均显著提高；同时成纤维细胞中肌特异性基因，如肌肉肌酸激酶基因、肌球蛋白轻链基因的 mRNA水平整体上有所提高；但是，转然后的细胞形态并没有发生显著变化，可能是因为myf6基因促进细胞分化的能力比较弱1。因此，可以猜测myf6基因可能具有肌细胞表达特异性。Huitao Fan等2通过对出生后的杜洛克和皮特兰骨骼肌中myf6基因的表达情况的检测，发现该基因对这两个品种的成年个体的肌肉生长具有促进作用。但其具体的表达机制还有待研究发现。2.2 HMGCS1基因在猪的不同组织中的表达水平及对猪肌肉生长发育的影响HMGCS1（人3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 合成酶 1）是HMGCS家族的成员之一，位于细胞质中。HMGCS1可影响肌肉生长发育过程中肌肉内脂肪的沉积，从而影响猪肉品质。有报道称，通过采用 SYBR Green 荧光定量 PCR法，对HMGCS1在通城猪背最长肌和其它组织中的表达量进行检测。发现，HMGCS1 基因在猪心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、小肠、背最长肌和皮脂等组织中都有表达，但是其表达量存在一定的差异。通过相关数据分析发现，HMGCS1 基因在肺中的表达最丰富远远高于其它组织（差异显著P0.05）；在肝脏中表达水平较高；而在心肌和背最长肌中表达量较低；在其它组织中表达量居中3。 研究还发现，从胚胎 33 d 至出生后 60 d，HMGCS1 基因都存在不同水平的表达量。结合Picard 等的研究发现，猪胚胎期 33 和 55 d 是骨骼肌初级纤维和次级纤维生成的关键点4，由此可以推测，HMGCS1 基因可能参与猪骨骼肌的生长发育。另外也有研究发现，猪背最长肌的初级纤维是从妊娠期的第3550d开始发育；次级纤维从妊娠期50天左右开始发育，且主要是在初级纤维表面增殖，可持续3540天5。由此，我们可以推测HMGCS1基因主要在初级肌纤维的形成过程中发挥作用。同时，孙伟等人研究还发现HMGCS1 基因的表达受miR-18a/b的调控。miR-18a/b 均可以在正常猪肌肉生长发育中发挥作用。通过双荧光素酶报告基因试验，发现miR-18a/b 可直接与 HMGCS1 基因的 3UTR 结合，对HMGCS1 有显著的下调作用，有效抑制了 HMGCS1 mRNA的表达。这说明：HMGCS1 在转录翻译过程中受miR-18a/b 的调控，是 miR-18a/b 的共同靶基因5。2.3 MyoD基因对动物肌肉生长发育的调节MyoD基因的全称是Myoblast Differentiation Antigen（成肌分化抗原），是以其命名的一个转录因子家族的重要成员。该家族成员的时空表达具有特异性，同时彼此之间具有差异性。其成员包MyoD基因都参与成肌细胞向肌细胞的转化过程，同时，MyoD基因还具有自激活作用，这对促进肌肉组织生长发育具有重要作用。MyoD受蛋白激酶(PKC)和调钙蛋白调节。2.3.1 MyoD基因对大鼠成纤维细胞向成肌细胞转化的影响MyoD基因在成肌细胞中对肌肉细胞的发育和分化可以起到促进作用，但有研究表明，将MyoD基因转入非肌肉细胞内,也能够启动生肌过程。同时,外源性MyoD基因的瞬时表达,还能能够激活内源性基因,促进肌肉生成6。基于这些发现，范慧敏等就对MyoD基因在体外对大鼠成纤维细胞分化为成肌细胞的作用进行了研究。实验利用慢病毒将大鼠MyoD基因转入大鼠成纤维细胞中；经过Blasticidin筛选; 再用RT-PCR和Western blot检测MyoD的表达。RT-PCR结果显示，MyoD基因在转染筛选的细胞中表达量较高，相应的未转染的对照组细胞则没有检测到MyoD基因的表达。Western blot结果显示，MyoD在转染后经过筛选的细胞中蛋白表达水平与mRNA表达水平是一致的,这就说明外源性的MyoD在转染的细胞中可以编码功能性的蛋白质。同时，在电子显微镜下观察转染的细胞，其核较大,核仁明显, 细胞质内还可见数量较多的粗面内质网及微丝、微管等肌细胞特征性结构7。另外，在大鼠MyoD cDNA和Cx43 cDNA共转染大鼠成纤维细胞的实验中，发现，MyoD和Cx43基因共同作用可诱导DFs（大鼠真皮成纤维细胞）分化为成肌细胞8。这些结果再次证明了，MyoD基因作为肌肉转录因子家族的成员之一, 其表达对维持肌肉细胞分化起着重要的促进作用。2.3.2不同猪品种肌肉组织发育过程中FoxO1对MyoD基因的影响在动物体内，MyoD基因对肌肉生长的调控并不是单独起作用的，它的表达还受到其它基因的调控。并且这一点也得到了证实，Siriett V Nicholas G, Berry C等人研究发现，FoxO1和MyoD基因之间存在着相互调控关系，FoxO1可能在MyoD调节肌肉发育中起着重要的介导作用9。为研究FoxO1和MyoD基因在不同猪品种肌肉组织中的表达情况以及相互关系，杨燕军等就对FoxO1和MyoD基因mRNA在六月龄大的猪（八眉猪与长白猪分别作父本和母本的杂交后代）肌肉中的表达情况进行了检测。RT-PCR检测结果显示，在不同经济类型猪品种肌肉组织中，两种基因的表达水平存在差异。FoxO1在八眉猪和杂交后代肌肉中的表达水平均高于长白猪；而MyoD的表达情况刚好相反，在长白和杂交后代肌肉中的表达水平都高于八眉猪10。由此可以推测，FoxO1基因在肌肉组织中很可能对MyoD基因mRNA的表达起到负调控作用。实验结果还发现，FoxO1 mRNA在脂肪型猪肌肉组织的表达丰度明显高于瘦肉型，并且与MyoD mRNA的表达呈负相关。说明，FoxO1可能是导致脂肪型猪和瘦肉型猪肌肉发育过程产生差异的主要基因之一。另外，也初步证明了FoxO1在脂肪型猪肌肉组织中可抑制MyoD对肌肉发育的正向调控，有可能在MyoD调控肌肉发育的信号通路中起负调控的作用。这个结论与Hribal和Bois P R等人用C2C12细胞系和小鼠所做的相关实验结果相符合11。但是，FoxO1对肌肉发育的具体调控机理还需要深入的研究。3 基因对肌肉生长的负向调控作用及其作用机制动物肌肉的生长除了受生肌决定因子(MyoD )、HMGCS1等基因的正向调控外，还受到一些负向调控因子的影响。其中肌细胞生长抑制素(MSTN Myostatin,又称GDF-8 growth differentiation factor 8), 就是近年来发现的一类重要的肌细胞生长调控因子。它是通过抑制MyoD家族成员的转录活性来负向控制肌细胞的生长发育,它的表达量与肌肉重量的变化呈负相关12。另外，上文提到过的FoxO1基因对肌肉的生长发育也起到负向调控的作用。FoxO家族是转录调节因子,也是INS/IGF1信号通路中的关键分子。FoxO受PI3K/PKB磷酸化级联通路的调节,其活性与其磷酸化状态直接相关, 对细胞增殖、细胞凋亡等生理过程有重要调节作用13。3.1 FoxO1基因对肌肉发育的调节及其机制 FoxO1是FoxO家族中最早被发现的成员, FoxO1作为潜在因子与骨骼肌的分化以及成肌细胞分化中的肌管形成有重要关系，可以在肌肉生长发育中对MyoD产生作用，抑制肌肉生长。虽然，在猪中尚未发现FoxO1基因通过MyoD调控骨骼肌发育与分化。但是，在大鼠、小鼠和细胞系中的相关研究表明，FoxO1可能作为一个潜在因子通过抑制MyoD表达来阻止骨骼肌分化14；另外，Kamei等15利用C2C12细胞系对FoxO1基因所做的实验发现，通过siRNA使Foxo1的表达抑制来提高肌浆球蛋白的表达水平，结果可促进肌细胞分化；同时，对转基因小鼠的研究发现，Foxo1基因通过负调控鼠骨骼肌的量和I型肌纤维基因的表达量，导致骨骼肌中I型纤维数量明显降低。这与杨燕军等10的相关实验结果：FoxO1基因的表达与I型肌纤维的含量成反比，是一致的。Bois等16研究发现，在鼠中，Foxo1显性失活突变体的基因表达增强，可阻止肌管形成。从而，在成肌细胞分化中调控肌管融合的速率。另外，Stitt等17发现，FoxO1和FoxO3转录因子的表达可上调两种泛素连接酶MAFbx和MuRF1的表达,从而引发骨骼肌萎缩。这些研究发现在一定程度上揭示了Foxo1对肌肉发育负向调控的作用机制。3.2 MSTN基因对肌肉发育的调节及其机制早在1997年，McPherron等就发现了生长与分化因子GDF-8。GDF-8在骨骼肌中表达可限制肌肉生长和分化, 又因该基因的缺失或该基因的敲除会使小鼠出现肌肉肥大的现象，所以又称该基因为肌肉生成抑制素(myostatin,MSTN)基因18。在此之后，多位学者都对MSTN基因的定位、结构、功能及其作用机制等方面做了大量研究。Salamonsen等19发现，MSTN是一种分泌型多肽, 属于TGF-B超家族，并且具有该家族共有的生物结构。对MSTN基因在动物体内表达情况的研究发现，该基因主要在哺乳动物骨胳肌中表达20，并且在生长期和成熟期的骨骼肌中均能表达21。李帅等18对猪的相关研究发现，在猪胚胎期的2l35 d可以检测到MSTN 基因表达,到49 d该基因mRNA水平开始明显增高；妊娠期第105 d开始降低,出生后14d达到最低水平；在猪整个生长期中,其骨骼肌、心肌和乳腺中均能进行表达。Sbarma等22也发现，在牛的骨骼肌中MSTN基因表达水平较高,在心肌细胞和浦肯野氏纤维中该基因表达水平则极低。另外，多年来对MSTN基因的研究使人们对其功能及其作用机理也有了一定的了解。早在上世纪90年代就有人报道称，MSTN基因是通过翻译的信号肽发挥调节肌肉生长和分化作用的23,24。2006年McFarlane等25做的体外实验发现，MSTN可通过抑制IGF1/PI3K/Akt骨骼肌增生通路导致肌肉萎缩；Akt的磷酸化被抑制,MSTN可以提高FoxO的活性,从而提高肌肉萎缩基因的表达。MSTN还可基因可通过调控细胞周期进程抑制成肌细胞增殖。它可以阻断细胞周期的和期，抑制成肌细胞的生长26。除此之外，FoxO1还可以结合在MSTN启动子区域,增强启动子活性,而诱导MSTN表达量增加,同时也增强了连接有MSTN启动子的荧光素酶载体的活性,进一步抑制成肌细胞的分化。这些发现虽然解释了MSTN基因的部分功能机制，但是要想彻底了解该基因的作用机理并将这些研究成果应用到实际生产中去，还需要对其进行更加深入的研究。4 总结动物肌肉的形成生长是一个极其复杂的生理过程，受到不同基因的调控。本文只是挑选了其中的几个相关基因，对它们在影响动物肌肉生长发育发面的功能作用极其作用机制进行了简单的阐述。动物肌肉的生长发育情况，对肉用经济动物的产肉量以及肉的品质都具有重要的影响。因此，研究肌肉生长发育的调控机制就具有重要的意义。虽然，众多学者从上世纪就开始在分子层面对动物肌肉的生长进行研究，并且也发现了不少能影响肌肉发育的基因以及它们的作用机制。但是，由于基因作用机理的复杂性，以及不同动物之间的差异性，更多的潜在的相关基因还有待被发现。同时，对现在已经发现的相关基因的功能也需要更深一步的研究，从而为畜牧业的发展提供更多的技术帮助。参考文献1 汤展毅，严云勤，高学军等. 牛myf6基因克隆及在成纤维细胞中的表达J. 东 北 农 业 大 学 学 报，2010; 41(11): 77-82.2 Huitao Fan , Mehmet Ulas Cinar, Chirawath Phatsara et al. Molecular mechanism underlying the differential MYF6 expression in postnatal skeletal muscle of Duroc and Pietrain breedsJ. GENE，2011; 486: 8143 孙 伟, 唐中林, 谭 林等. HMGCS1 基因对猪肌肉生长发育的影响及miRNA-18a/b 对 HMGCS1 基因的调控J. 中国农业科学，2013,46(12):2543-2549.4 Picard B, Lefaucheur L, Berri C, Duclos M J. Muscle fibre ontogenesis in farm animal species. Reprod Nutrition DevelopmentJ,2002; 42(5): 415-431.5 Wigmore P M C, Stickland N C. Muscle development in large andsmall pig fetuses. Journal of AnatomyJ.1983, 137(2): 235-245.6 Polesskaya A, Rudnicki MA. A MyoD-dependent differentiation checkpoint: ensuring genome integrityJ. Dev Cell, 2002,3(6):757-758.7 范慧敏,李 阳,卢 蓉等. MyoD基因诱导大鼠成纤维细胞转化为成肌细胞的研究J. 同济大学学报(医学版), 2007; 28(4).8 张旭敏,李淑梅,范慧敏等. 生肌调节因子和连接蛋白43基因诱导大鼠成纤维细胞分化为肌细胞实验研究J.中国老年学杂志,2008;5.9 Siriett V, Nicholas G, Berry C,et al. Myostatin negatively regulates the expression of the steroid receptor co-factor ARA70 . J Cell PhysiolJ, 2006,206(1):255-263.10 杨燕军, 白 亮, 庞卫军等. 不同猪品种肌肉组织FoxO1与MyoD基因mRNA的表达及其相关性分析J. 中国生物化学与分子生物学报, 2008; 24(3):257-261.11 Hribal ML, Nakae J, Kitamura T,et al. Regulation of insulin-like growth factor-dependent myoblast differentiation by Foxo forkhead transcription factors J. J Cell Biol, 2003,162(4):535-541.12 刘丑生,赵兴波,李 宁等. 动物肌肉生长发育调控的功能基因研究进展J. 中国畜牧杂志, 2003; 39(5)48-49.13 崔 旻，赵 勇. FoxO转录因子J. 中国生物工程杂志, 2004; 24(3)40-43.14 Allen D L, Unterman T G. Regulation of myostatin expression and myoblast differentiation by FoxO and SMAD transcription factors J. Am J Physiol Cell Physiol, 2007,292(1):C188-199.15 Kamei Y, Miura S, Suzuki M,et al. Skeletal muscle FOXO1(FKHR) transgenic mice have less skeletal muscle mass, down regulated type I (slowtwitchPredmuscle) fiber genes, and impairedglycemic control J. J Biol Chem, 2004,279(39):41114-41123.16 Bois P R, Brochard VF, Salin-Cantegrel AV,et al. FoxO1a-cyclic GMP-dependent kinase I interactions orchestrate myoblast fusion J.Mol Cell Biol, 2005,25(17):7645-7656.17 Stitt, Doreen Drujan, Brian A. The IGF-1/PI3K/Akt Pathway PreventsExpression of Muscle Atrophy-Induced UbiquitinLigases by Inhibiting FOXO Transcription FactorsJ. Molecular Cell, Vol. 2004; (14) 395403.18 李 帅,杨舒黎,苟 潇等. 肌肉生成抑制素(MSTN)基因研究进展J. 中国畜牧兽医. 2011; 38(2)60-63.19 Salamonsen L A,Dimitriadis E,Robb L.Cytokines in implantation.Seminar in Reproductive Medicine, 2000,18(3):299-310.20 H. Kocamis a, J. Killefer. Myostatin expression and possible functions in animal muscle growth. Dome