第九讲基因组学与蛋白质组学(2017.4).ppt

基因组学与蛋白质组学 第九讲 SongFangzhou2017 4 学科发展的趋势结果展望GeneGenomeGenomicsProteinproteomeProteomics 生命科学的重大基石 中心法则 DNARNA蛋白质 基因组学 转录组学 蛋白质组学 依据和支撑 第一节基因组学与人类基因组计划 一 基因组 Genome 是指生物细胞中所有的DNA 包括所有的基因和基因间区域 人的核基因组大约有30亿个 最新资料说28 5亿个 硷基对 bp 2 2 5万个蛋白编码基因 这些编码区仅占整个基因组很少一部分 不到3 而大部分是非编码区 二 基因组学 Genomics 简言之 就是研究基因组结构和功能的科学 其内容包括基因的结构 组成 存在方式 表达调控模式 基因的功能和相互作用等 基因组学分支 结构基因组学功能基因组学比较基因组学 导言 基因组学产生的历史背景有史以来 人类就在为认识自身进行着不懈的努力1 自从人们认识到 基因决定生物性状 达尔文到孟德尔 2 基因的本质就是核酸 主要是DNA 1944 之后 就从来没有停止对基因的研究 3 但真正有系统地研究基因组 解码生命还是于1990年人类基因组计划启动后才开始的 人们回顾过去的20世纪一百年中所取得的辉煌成就时 认为最激动人心的伟大创举之一就是和 曼哈顿原子弹计划 阿波罗人类登月计划 一起被誉为20世纪科学史上三个里程碑的 人类基因组计划 humangenomeproject HGP 这项人类生命科学史上最伟大的工程 第一次系统 全面地解读和研究人类遗传物质DNA 它不仅具有重大的理论意义 而且对国计民生特别是生物医学的发展更具有重大的现实意义和深远的历史意义 三 人类基因组计划 1985年5月 美国能源部提出 人类基因组计划 humangenomeproject HGP 草案 经过一番讨论后于1986年3月宣布实施这个草案 1986年3月7日 DulbeccoR在Science上发表了一篇有关开展人类基因组计划的短文 引起了全世界的强烈反响 不仅推动了美国 也推动了全世界的人类基因组计划的发展 1988年2月 国家科学研究委员会的专家成立了 国家人类基因组研究中心 1990年10月1日美国国会正式批准的 人类基因组计划 计划在15年内投入30亿美元以上的资金进行人类基因组的分析 即对人类3 109个核苷酸进行测序 1 HGP的内容人类基因组作图及序列分析 基因的鉴定 基因组研究技术的建立与创新 模式生物基因组作图和测序 信息系统的建立 储存及相应软件的开发 相关产业的开发等 2 基本任务可用4张图谱来概括 即遗传图 物理图 转录图 基因图 序列图 A 遗传图 geneticmap 又称连锁图 linkagemap 是以具有遗传多态性的遗传标记作为 位标 遗传学距离为 图距 的基因组图 需要应用多态性标志 1 RFLP 2 VNTR 重复顺序 卫星序列 3 SNPs 四 HGP的内容 任务与进展 B 物理图谱 physicalmap 是以一段已知核苷酸的DNA片段为 位标 以DNA实际长度 Mb或Kb 作为图距的基因组图 C 转录图 transcriptionmap 是以表达序列标记 expressedsequencetags EST 作为位标 实际上就是人类 基因图 的雏形 又称cDNA图或 表达序列图 D 序列图 sequencemap 也就是人类基因组核苷酸序列图 是分子水平上最高层次 最详尽的物理图 这四张图被誉为人类 分子水平上的的解剖图 或 生命元素周期表 可见其重要性 遗传图谱 基因图谱 序列图谱 物理图谱 100kbSTSmap 序列标签位点 1kb或0 7cM 3 进展随着工作的开展和私有企业压力的加大 时间表在不断提前 例如 原定2005年完成的序列图谱已被两次提前至2001年 迄止2004 5 26 已完成了9条染色体的测序和分析 最近完成了第9号和10号染色体图谱的绘制工作 认为癌症 糖尿病和阿耳茨海默氏症与这两条染色体有关 中国的HGP始于1994年 是在吴旻 强伯勤 陈竺 杨焕明等人的倡导下启动的 1998年3月由陈竺院士挂帅成立上海中心 10月改名为中国南方基因中心 1999年由强伯勤院士挑头在北京先后成立了中国科学院北京人类基因组中心和北方人类基因组中心 在2000年6月完成 工作框架图 在2001年3月 Science和Nature同时发表了人类基因组草图 人类基因组计划的测序基本上是完成了 2003年4月HGP正式宣告全部完成 各项指标均如期完成 1999年9月 中国积极加入这一研究计划 负责测定人类基因组全部序列的1 贡献率 1 也就是3号染色体短臂上的3000万个碱基对 中国因此成为参与这一研究计划的唯一发展中国家 截至2000年5月30日 中国科学院遗传研究所人类基因组中心已经完成了所承担的人类基因组3p区域 工作框架图 的任务 原申报的三项指标均如期完成 人类基因组中约有 万到 万个蛋白编码基因 2001年 现在认为只有2万个左右 2004 10 21 比原先预计的10万个基因数要少得多 五 HGP的几个阶段性工作 Mouse 30 000 Mouse 最新研究显示人类基因数量比原先估计少得多 这是人类与其他种类基因数量的比较 2004 10 21 Nature 资料 产生一个爱因斯坦只需比线虫多了约一万二千个基因 实际只多500 5 500 或是比果蝇多了一万七个左右的基因 实际只多6 400 11 400 生物体的复杂度为什么并没有与其基因数量之间建立必然的联系呢 其原因可能是 1 在于RNA切割作用可以保证从单个基因产生多个蛋白质产物 2 脊椎动物基因比无脊椎动物基因会产生更多的这种切割 3 神经系统发达的程度与这种数值是相关的 线虫比果蝇迟钝 就需要更多的特异蛋白质 相应更多的基因数 来对环境或天敌做出反应 同样更迟钝的植物 需要不断地进化出新基因来对付不断出现的新敌人和各种天气环境的变化 mRNA DNA hnRNA splicing 蛋白质 e i 翻译 转录 我们之所以同苍蝇和线虫不同 是由于我们的蛋白质要复杂得多 我们额外的基因并没有翻译出许多新的蛋白质种类 然而 它们用新的方法重构了古老蛋白质的一些不同的部位 蛋白质后修饰 使我们成为人类的是那些在生命的不同时期控制基因开启和关闭的复杂内在机制 第二节蛋白质组学 生命是蛋白体的存在方式 这个存在方式的基本因素在于和它周围的外部自然界的不断地新陈代谢 而且这种新陈代谢一停止 生命就随之停止 结果便是蛋白质的分解 恩格斯 一 蛋白质组学和蛋白质组计划产生的历史背景人类基因组计划 HGP 被誉为20世纪的3大科技工程之一 经过各国科学家十几年的的努力 人类基因组计划 HGP 已取得了巨大成绩 整个计划已提前完成 所取得的划时代研究成果 人类基因草图的完成宣告了一个新的纪元 后基因组学 post genomics 时代 的到来 其中 功能基因组学 functionnalgenomics 成为研究的重心 蛋白质组学 protromics 则是其 中流砥柱 InTheNews If2000wastheyearoftheGenome 2001willbetheyearoftheProteome NightlyBusinessReport12 27 00 TimeMagazine7 3 00 C ENews7 31 00 科学家们已将蛋白质组学的地位提高到前所未有的高度 认为是功能基因组学这一前沿研究的战略制高点 将成为新世纪最大战略资源 人类基因争夺战的重要 战场 也就是说 如何将人类基因组计划所获知的人类基因序列转变为对人类自身认识的知识 如何对这些基因加以利用呢 科学家们认为 生命科学已进入了后基因组学时代 而功能基因组学的研究 则可能是这一时代的核心内容 功能基因组学主要是采用一系列新技术 对成千上万的基因表达进行分析比较 并从基因整体水平上对基因的活动规律进行阐述 它抛弃了经典分子生物学零敲碎打地研究各别基因的习惯 力求从细胞水平上解决基因组问题 以建立对生命现象的整体认识 但是 生命现象的主要体现者是蛋白质 而蛋白质有其自身的特定活动规律 仅仅从基因的角度来研究是远远不够的 因此 旨在整体水平上研究细胞内蛋白质的组成及其活动规律的新兴科学 蛋白质组学 Proteomics 也就应运而生了 医药学领域应用 近十多年来 蛋白质组学研究迅猛发展 已被广泛应用于医学研究的各个领域 它着眼于对蛋白质整体水平的研究 成为阐明基因组的功能 揭示生命奥秘的一个新的技术平台 在疾病方面 探讨蛋白质与疾病之间的关系 在药学范畴内 它针对药物靶点的识别 药效评价 药物毒理学研究 分子药理模型的构建以及抗体的制备等进行研究 在药物开发方面已显示出巨大的潜力 生物体本身 1 在生物体内 基因组是遗传密码的携带者 而真正的功能性分子却是蛋白质 2 只有通过研究蛋白质 我们才有可能读懂人类基因组这本 天书 3 蛋白质在生物体内的表达具有时空性和复杂性 首先 在特定的发育阶段 不同的细胞内外环境 一个基因可以表达出不同数量 不同种类的蛋白质 从而产生不同的生物学功能 4 再有 基因编码的蛋白质产物也并非一成不变的 最为突出的就是蛋白质的翻译后修饰 据统计 蛋白质在翻译后大约有200种的修饰形式 如磷酸化 糖基化 乙酰化 烷基化等 这些变化不仅改变了蛋白质的空间构象 而且 往往是蛋白质发挥功能的活性基础 由于单基因病仅占所有疾病的2 左右 大多数疾病都是发生在蛋白质水平 因而利用蛋白质组学技术 借助研究蛋白质的表达丰度 性质和相互作用 我们就可以进一步探索疾病的诊疗方法和药物的开发 对生命现象的研究有三个水平 基因组 转录组 RNA 和蛋白质组 基因组告诉我们理论上将会发生什么 转录组告诉我们可能会发生什么 蛋白质组则告诉我们正在发生什么 蛋白质是生命活动的真正执行者 细胞是生命活动的基本单位 基因和蛋白质的功能最终必须在细胞中整合起来并得以真正体现 基因好比一张制造火车的图纸 蛋白质就是根据图纸制造的真正有运输能力的火车 虽然目前已完成了对人类基因的全部DNA序列测定 但是单凭制造火车的图纸 还不会跑起来 也不可能实现物资和旅客的运输任务 二 为什么要进行蛋白质组研究 以疯牛病和人类克雅病 Creutsfeldt disease CJD 为代表的可传染性海绵状脑病 transmissiblespongi formencephalopathies TSE 为一类致死性神经系统疾病 其感染因子是一种与正常细胞膜蛋白 PrPC 一级结构完全相同 但高级结构 理化特性不同的PrPSc或prion蛋白 阮蛋白 目前的研究提示 这种不含有核酸的prion蛋白似乎具有自身复制的能力 也就是说这种蛋白本身就储备了生命活动必需的遗传信息 这就提示我们 在自然界中可能还存在着一种全新的微小生命体 一种无核酸的微小生物体 从而改变人类对整个生物界的认识 即蛋白质不仅可体现生物学功能 而且可储存遗传信息 而核酸成分可能在prion复制过程中完全缺如 这将有力地挑战目前的 生物中心法则 PrP蛋白高级结构的改变不仅可造成蛋白质功能的变化 在某种意义上还是遗传信息传递的方式 三 蛋白质组和蛋白质组学概念蛋白质组一词由澳大利亚科学家Wilkins和Williams在1995年7月首次提出 蛋白质组 proteome 一词 源于蛋白质 protein 与基因组 genome 两个词的复合 意思是Proteinsexpressedbyagenome 即由基因组表达的蛋白质 是指 一种基因组所表达的全套蛋白质 即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质 实际上 它有3种不同的含义 1个基因组 1种生物或1种细胞所表达的全套蛋白质 蛋白质组是一个动态的概念 蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础 也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径 蛋白质组学 Proteomics 以蛋白质组为研究对象的崭新研究领域 蛋白质组学提供了一套在蛋白质水平大规模研究基因功能的有用工具 它旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式和功能模式 其内容包括蛋白质表达 存在方式 结构 功能和相互作用等 四 蛋白质组学研究的技术路线蛋白质组学是以蛋白质为研究对象的崭新研究领域 主要采取以下技术路线 蛋白质组技术2D Electrophoresis 双向电泳 MassspectrometryBioinformatics 质谱分析 生物信息学 样品提取 生物体组织 细胞 体液 ICAT全景式蛋白质定量技术 离心 LC纯化 纯化BioCAD多维色谱 图像分析 2 DGel PVDF膜 SPOT切割 SDS PAGE 酶解 多肽片段 173A毛细管HPLC纯化及样品制备 纯化BioCAD纯化系统 SYMBIOTI样品处理系统 PROCISE蛋白测序仪 飞行时间质谱仪VOYAGERSTRMALDI TOFESIQq TOFESI TOF 肽序列测定 肽指纹谱PMF 蛋白质信息数据库检索ABIInformatics 蛋白识别 PROTEINID 五 蛋白质组学研究的意义1 基因功能的信息通过基因所编码的蛋白质表现 蛋白质为生物功能的执行者 2 大多数疾病与蛋白质的非正常表达相关 3 蛋白质本身就是药物作用的靶点 许多蛋白质就是药物 4 疾病在蛋白质水平上进行治疗 5 蛋白质的空间性 时效性 修饰 不稳定性 复杂的相互作用等决定了蛋白质研究远比基因组研究复杂 6 蛋白质组研究将阐明基因产物的调控机理 生化路径 蛋白质相互作用 7 蛋白质组研究将翻开新药发现开发的新篇章 六 蛋白质组学的研究方法蛋白质组研究是三者 基因组 转录组 RNA 和蛋白质组 中难度最大的 蛋白质的结构和功能的复杂性超乎寻常 蛋白质研究手段的不完善 使得蛋白质组的研究进展远远落后于DNA和RNA 2D 电泳和新的质谱技术的应用 使蛋白质组的研究焕发了生机 蛋白质组研究主要从两个方面 一是对蛋白质组成 表达模式 的研究 1 双向凝胶电泳 two dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis 2D GE 2 质谱 massspectrum MS 技术 二是对蛋白质组功能模式的研究 酵母双杂交系统 yeasttwo hybridsystem 2D GE是一种分离和测定复杂生物体系中蛋白质的方法 根据蛋白质等电点和分子量的不同 第一向按蛋白质的等电点不同对样品进行等电聚焦分离 第二向根据分子量大小用SDS PAGE 十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 进行分离 理论上利用SDS PAGE可以一次分辨出5000 10000个蛋白质组分 结合放射自显影技术可检测出含量占样品中蛋白质总量10 6 10 7的组分 纯度达99 以上 双向凝胶电泳技术包括 样品制备 溶解和增溶 样品预处理 预分级分离 等电聚焦SDS PAGE电泳后蛋白质的回收等技术 七 目前急需解决的问题 低拷贝蛋白质的检出 极酸 极碱蛋白质的分离 过大 200 103 或过小 10 103 蛋白质的分离 难溶解电脑子的检测 尤其是疏水蛋白质 二维谱上蛋白质点数和量的重复性及分辨效率有待提高 能自动进行SDS PAGE的仪器和与之相配套的软件的研制开发 八 蛋白质芯片技术1 概念 蛋白质芯片 proteinchip 也叫蛋白质微阵列 proteinmicroarray 是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上 利用蛋白质与蛋白质 酶与底物 蛋白质与其他小分子之间的相互作用 检测分析蛋白质的一项新技术 是生命科学与微电子学等学科相交叉的一门高新技术 与基因芯片一样 具有高通量 平行性 微型化 自动化的特点 由于蛋白质芯片是高通量 微型化和自动化蛋白质分析技术 通过芯片表面探针蛋白质点阵 可特异地捕获样品中的靶蛋白 然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析 2 原理 利用抗体抗原结合原理 采用化学发光或荧光检测标记抗体或抗原 来检测抗原或抗体 3 蛋白质芯片的类型 1 蛋白质微阵列 2 三维凝胶块芯片 3 微孔板蛋白质芯片 2002年2月 由军事医学科学院贺福初院士 复旦大学化学系杨凡原教授一起主持这项5年内资助额达3500万元的重大课题研究 以严重影响我国人群健康的重大疾病 如肝炎 肝癌 心血管病等 为对象 发掘与上述疾病发生发展密切相关的蛋白质群 为重大病症的防诊治提供新的预警 诊断标志物和新的药物靶标等 2002年10月成立了 中国人类蛋白质组组织 2003年4月正式以 人类肝脏蛋白质组计划 这是世界上第一家以蛋白质组计划率先启动 九 我国 人类重大疾病的蛋白质组学研究 启动 最近的一些研究进展 1 Science 报道 美国和日本科学家发现了一种通过影响胰岛素分泌延长老鼠生命的蛋白质 克洛托 克洛托是希腊神话中纺织生命之线的女神控制着人的寿命 科学家们培育的突变种系老鼠体内的克洛托基因导致产生更多的蛋白质 使其寿命比正常的老鼠长19 31 2 韩国科学家已经克隆出用于生产治疗癌症蛋白的转基因猪 4只母猪 这四只母猪将产生含有粒细胞 巨噬集落刺激因子 GM CSF 的猪奶 GM CSF是一种刺激白细胞产生的蛋白 可用于治疗白血病或贫血症 或对白细胞低的癌症患者进行治疗 现在的价格是60万美元 克 其前景非常诱人 3 Nature 2005 8 31 报道 美国华盛顿大学的罗伯特 沃特森博士等科学家研究发现了人类和黑猩猩有96 的基因一模一样 但就这微小 4 差异意义非常重大 它可能有助于解释为何人类会患阿耳茨海默氏症及一些癌症甚至艾滋病 而黑猩猩却很少得 认为这些差异可能影响那些具有重要生物学意义的蛋白质 4 基国际著名血液学杂志 BLOOD 近日刊登了一项令人振奋的最新研究进展 中国科学家 浙江大学医学院的徐荣臻博士研究小组 通过多年研究 找到了白血病的致病元凶 PTPN11