大肠菌群检验作业指导书.doc

大肠菌群检验作业指导书 大肠菌群检验作业指导书1目的规定大肠菌群的检验方法，保证按标准化操作。 2适用范围大肠菌群检测。 3术语大肠菌群在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。 4职责微生物检测员负责按作业指导书进行检验。 5工作流程图见附件 一、附件二6内容及要求6.1设备和材料6.1.1生化培养箱3616.1.2净化工作台6.1.3显微镜6.1.4天平感量0.1g6.1.5三角瓶500mL6.1.6试管18180mm6.1.7刻度吸管1mL、10mL6.1.8灭菌玻璃珠直径约5mm6.1.9灭菌培养皿90mm6.1.10冰箱256.2培养基和试剂6.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）6.2.2煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）6.2.3生理盐水（0.85%）121高压灭菌15min6.2.4结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）6.2.575%乙醇溶液6.3操作步骤6.3.1取样杀菌后的产品，按照每天生产时杀菌循环釜数的首、中、尾釜的第6篮中心位置样品1罐，罐底注明釜号、篮数、循环数、生产日期和线别，记录于成品抽样记录表，检验员从原始样品中取前、中、尾釜的第6篮的样品，即标识为“XR Y6”的样品做大肠菌群培养；如一釜杀菌篮数不足6篮，则抽取最后一篮的样品。 6.4操作步骤与方法6.4.1大肠菌群MPN计数法取待检样品10mL、1mL、1mL(取样品1mL注于含有9mL灭菌生理盐水中稀释，振摇试管混匀)，分别接种于含10mL双料、10mL单料和10mL单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）内，每个稀释度各接种三管，置361生化培养箱内培养24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h2h。 记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。 未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 6.4.1.1复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，361生化培养箱内培养48h2h小时，观察产气情况。 产气者，计为大肠菌群阳性管。 6.4.1.2大肠菌群最可能数（MPN）报告确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每mL样品中大肠菌群的MPN值。 6.4.2大肠菌群平板计数法6.4.2.1每个待检样品接种2个无菌平皿，每个皿1mL，同时分别取无菌生理盐水加入到两个无菌平皿作空白对照。 及时将冷却至46的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）15-20mL倾注于每个皿中，小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3-4mL的结晶紫中性红胆盐覆盖平板表层。 翻转平板，置361培养18-24h。 6.4.2.2选取菌落数在15CFU150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。 6.4.2.3证实实验从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种与煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，361生化培养箱内培养24-48h，观察产气情况。 产气者，计为大肠菌群阳性管。 6.4.2.4平板计数法报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以6.3.2.2中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。 例10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLG肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为1006/10104/g(mL)=6.0105CFU/g(CFU/mL)。 7相关文件食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数8质量记录表单成品微生物检测记录表MPN检索表如下接种量（mL）MPN接种量（mL）MPN0.130.0130.00130.10.0130.00130001100注上表采用3个稀释度（0.1mL、0.01mL、0.001mL）,每稀释度3管；表内所列检样各增加10倍时，则表内数字相应降低10倍；表内所列检样各降低1