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革兰阳性球菌 革兰阳性球菌 是指革兰染色为阳性的一群球菌 与医学有关的兼性厌氧球菌有9属通常引起化脓性感染 故又称化脓性球菌 pyogeniccocci 本章主要介绍葡萄球菌属 链球菌属 肠球菌属 专性厌氧球菌在第十六章厌氧菌中介绍 第一节葡萄球菌属 葡萄球菌属 Staphylococcus 在自然界广泛分布 存在于人和动物的皮肤黏膜上的菌株可致多种化脓性感染疖 痈 脓肿 菌血症等烫伤样皮肤综合症毒性休克综合症 一 分类 葡萄球菌属目前有35个种 17个亚种凝固酶凝固酶阳性葡萄球菌凝固酶阴性葡萄球菌 Coagulasenegativestaphylococcus CoNS 噬菌体分型可将金黄色葡萄球菌分成4 5群26型质粒分型 血清学分型 抗生素分型和细菌DNA的RFLP或PFGE分型 用来研究细菌的致病性 耐药性 流行病学特点和细菌鉴别的关系 分类 引起人类疾病的重要菌种有金黄色葡萄球菌 S aureus 表皮葡萄球菌 S epidermidis 头状葡萄球菌 S capitis 人葡萄球菌 S hominis 腐生葡萄球菌 S saprophyticus 其余尚有一些能在人体中分离到溶血葡萄球菌 沃氏葡萄球菌 模仿葡萄球菌 里昂葡萄球菌 施氏葡萄球菌 巴氏葡萄球菌 耳葡萄球菌 孔氏葡萄球菌 木糖葡萄球菌 解糖葡萄球菌 山羊葡萄球菌 普氏葡萄球菌 中间葡萄球菌等 二 临床意义 凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌是人类重要致病菌可引起社区和医院感染感染常以急性 化脓性为特征 如果未经有效治疗 感染可扩散至周围组织或经菌血症转移至其他器官常见的感染疖 痈 外科切口 创伤等局部化脓性感染和骨髓炎 化脓性关节炎 肺炎 心内膜炎 脑膜炎 菌血症等全身性感染 临床意义 致病性主要与各种侵袭性酶类和多种毒素有关肠毒素引起食物中毒 表现为急性胃肠炎噬菌体II群产生的剥脱毒素 或称表皮溶解素 可引起人类烫伤样皮肤综合征多见于新生儿 幼儿和免疫功能低下的成人皮肤呈弥漫性红斑和水疱形成 继以表皮上层大量脱落由噬菌体 群产生的毒性休克综合征毒素 I ToxicshocksyndrometoxinI TSST 1 属超抗原家族 刺激T细胞诱发TNF和IL 1可致机体多个器官的功能紊乱或引起毒性休克综合征 TSS 临床意义 CoNS是人体皮肤黏膜正常菌群之一是医院感染的主要病原菌表皮葡萄球菌人工瓣膜性心内膜炎 静脉导管感染 腹膜透析性腹膜炎 血管移植物感染和人工关节感染等腐生葡萄球菌女性尿路感染的重要病原菌其他凝固酶阴性葡萄球菌重要的条件致病菌和免疫受损患者的感染菌产生荚膜多糖或糖萼有关增强细菌与外来物质 生物性瓣膜 导管等 表面的粘附或在其表面形成一层生物膜而保护细菌对抗杀菌物质作用 三 生物学特性 直径0 5 1 5 m 革兰阳性球菌呈单个 成双 短链 液体培养基或脓汁中 或成簇排列呈葡萄串样 无鞭毛和芽胞 某些菌株能形成荚膜在金黄色葡萄球菌的细胞壁有葡萄球菌A蛋白 具有抗原性大多为兼性厌氧菌 对营养要求不高 最适生长条件35 37 pH7 4 7 6 普通培养基上形成直径2 3mm不透明的圆形凸起菌落产生金黄色 白色 柠檬色等非水溶性色素附着在菌落上 生物学特性 金黄色葡萄球菌血琼脂平板上菌落周围有透明溶血环 能在含10 15 NaCl琼脂中生长该菌的抵抗力比其他无芽胞细菌强 耐干燥近年来耐药性增强 对多种抗菌药物不敏感生化反应活泼 能分解多种糖类和蛋白质 触酶阳性该属细菌DNAG Cmol 为30 39 酶和毒素 葡萄球菌属产生多种酶和毒素产生2种血浆凝固酶结合凝固酶或聚集因子是结合在菌体表面的凝固酶 能与血浆中的纤维蛋白原交联使菌体快速凝集游离凝固酶是细菌分泌到菌体外的凝固酶 能被血浆中的协同因子 cofactor 激活形成复合物 再使纤维蛋白原转变成纤维蛋白 而使血浆凝固 酶和毒素 耐热核酸酶葡萄球菌溶素有 等破坏红细胞 白细胞 血小板以及肝细胞等肠毒素是一组对热稳定的可溶性蛋白质 耐热100 30min 分子量为26 30kDa 能够抵抗胃肠液中蛋白酶的水解作用根据抗原性和等电点的不同可分为A B C1 C2 C3 D E G和H等9个血清型 以A D型多见编码肠毒素基因大多位于染色体上 D型由质粒编码 酶和毒素 毒性休克综合征毒素透明质酸酶 磷脂酶 触酶 杀白细胞素和表皮剥脱毒素等携带诱导性的青霉素酶和乙酰基转移酶质粒 通过转导进行质粒的转移部分菌株通过获得外源性的macA基因而产生青霉素结合蛋白2a PBP2a 导致对所有 内酰胺类抗生素耐药 四 微生物检验 一 检验程序 二 标本采集 根据感染的部位 采集不同的标本 该属细菌广泛分布在人体皮肤和黏膜 采取时避免病灶周围正常菌群污染 三 标本直接检查 无菌体液如脑脊液和关节穿刺液可使用涂片 革兰染色后直接显微镜检查 查见细菌具有重要临床价值 其他体液标本如同时伴有炎性细胞时则直接显微镜检查结果也具有参考价值 涂片检查发现有形态相似的革兰阳性球菌 则可初步报告 查见类似葡萄球菌属革兰阳性球菌 并进一步进行分离和鉴定予以证实 四 分离培养与鉴定 脓液 分泌物等接种于血琼脂平板有污染的标本如粪便等应接种在选择平板上 如甘露醇高盐平板 哥伦比亚多粘菌素奈啶酸平板血液标本则用肉汤增菌培养基 葡萄球菌属内各菌种鉴定方法 1 菌落性状 金黄色葡萄球菌直径6 8mn 金黄色或橙色 菌落周围出现或不出现透明溶血环表皮葡萄球菌直径为5 6mm 某些产粘液菌株能粘附在琼脂平板表面 无色或白色溶血葡萄球菌直径5 9mm 不透明 无色素或奶油色 黄色里昂葡萄球菌直径4 7mm 边缘整齐稍扁 奶色 黄色和沃氏葡萄球菌相似腐生葡萄球菌直径5 8mm 白色或柠檬色菌落外观疑为葡萄球菌者应进行革兰染色证实甘露醇高盐平板上金黄色葡萄球菌菌落为黄色 2 凝固酶试验 有玻片法和试管法两种玻片凝固酶试验 测定结合型凝固酶试验时挑取少数菌落培养物 不能用生长高盐琼脂上的菌落 加入1滴血浆 10秒内观察细菌聚集和凝块形成金黄色葡萄球菌 中间型葡萄球菌呈现阳性反应 2 凝固酶试验 试管凝固酶试验 测定分泌型凝固酶以孵育过夜的牛心脑浸液肉汤培养物和血浆在37 水浴中孵育4h 观察凝块形成 如试验结果为阴性者再置室温18 24h 因某些菌种 中间葡萄球菌 猪葡萄球菌 的凝集出现所需时间长于4h必须注意某些菌株产生的葡激酶在延长孵育时间后可使凝块溶解使之产生假阴性若使用的不是无菌血浆可产生假阳性或假阴性结果 细菌不是纯培养物或污染可导致假阳性 3 耐热核酸酶试验 大多数金黄色葡萄球菌 施氏葡萄球菌 中间葡萄球菌 猪葡萄球菌能产生耐热核酸酶 表皮葡萄球菌 模仿葡萄球菌 肉葡萄球菌含微弱耐热核酸酶 4 磷酸酶试验 大多数的表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌 施氏葡萄球菌 中间葡萄球菌和猪葡萄球菌为阳性 将待测菌种点种在加有硝基酚磷酸盐的pH5 6 6 8MH琼脂上 孵育18 24h 菌落周围出现黄色为阳性 5 吡咯烷酮芳基酰胺酶试验 溶血葡萄球菌 里昂葡萄球菌 施氏葡萄球菌和中间葡萄球菌为阳性 将孵育24h斜面培养物接种在含吡咯烷酮 萘基酰胺 PYR 肉汤中 使细菌浓度调整为2号麦氏管浊度 35 孵育2h 加入PYR试剂后2分钟内呈现深紫红色为阳性 6 其他鉴定试验 常用的葡萄球菌属种间细菌的鉴定生化试验鸟氨酸脱羧酶试验 脲酶试验 半乳糖苷酶 3 羟基丁酮酸试验 新生霉素敏感试验 多粘菌素B耐药试验 糖产酸试验 五 肠毒素检测 动物学试验经典的方法是采用幼猫腹腔注射 肉汤培养物或呕吐物 4h内发生呕吐腹泻和体温升高或死亡等现象者 提示金黄色葡萄球菌肠毒素存在琼脂扩散试验或ELISA法测定用琼脂扩散试验测定待测标本中的金黄色葡萄球菌肠毒素与相应抗毒素在琼脂糖中进行双相扩散 观察有无沉淀线产生将抗毒素包被在固相载体中以双抗体夹心ELISA法检测样本中的肠毒素 第二节链球菌属 链球菌属 Streptococcus 细菌种类多 分布广其中某些菌种为毒力强的致病菌另一些则是作为正常菌群栖居于宿主的呼吸道 消化道 泌尿生殖道还有一些是皮肤上的过路菌和黏膜上的定居菌 一 分类 链球菌属的分类较为复杂传统分类以血平板上溶血现象Lancefield抗原血清分型种系分类法链球菌属的分类较以前的分类有较大的变化 传统分类 根据链球菌属各种细菌在血平板上的溶血现象甲型 溶血性链球菌乙型 溶血性链球菌不出现溶血的丙型 链球菌根据Lancefield抗原血清分型分为A B C D 等20群血清群与溶血特性没有相关性 对人类致病的主要是A群 种系分类法 根据种系分类法的研究结果原来归属为D群链球菌的肠球菌和N群链球菌已分别独立为肠球菌属 Enterococcus 和乳球菌属 lactococcus 遗传学和血清学分型不能统一在遗传学上相关的同种细菌其抗原可出现异质性毫无相关的菌种可出现同一抗原 根据伯杰鉴定细菌手册第9版 链球菌目前分为40个种和亚种 传统的分类方法 溶血性链球菌A C G群抗原菌落直径大于0 5mmA群的化脓性链球菌 S pyogenes C群 G群的马链球菌 S equi 和似马链球菌 S equismilis 菌落直径小于0 5mm具A C G群抗原 统称米勒链球菌 S milleri 咽喉炎链球菌 中间型链球菌和星座链球菌还有 溶血和不溶血的细菌B群抗原无乳链球菌 S agalactiae 传统的分类方法 溶血性链球菌包括肺炎链球菌 S pneumoniae 草绿色链球菌群 Viridansstreptococci 不溶血D群链球菌牛链球菌 S bovis 二 临床意义 化脓性链球菌是致病力最强的一种链球菌能产生多种毒素链球菌溶素O和S红疹毒素M蛋白 脂磷壁酸酶 链激酶 链道酶 透明质酸酶等 可引起急性咽炎 呼吸道感染 丹毒 脓疱病 软组织感染 心内膜炎和脑膜炎等产毒株还可引起猩红热可致感染后的变态反应性疾病如急性肾小球肾炎 风湿热等近年来报道引起毒素休克综合征 临床意义 无乳链球菌是新生儿菌血症和脑膜炎的常见菌该菌定居于妇女生殖道能导致新生儿感染早发型新生儿感染多发病于出生后24h 以肺炎为主晚发型为产后7天至3月内 以脑膜炎和菌血症为主B群链球菌对成人侵袭力较弱主要有肾盂肾炎 子宫内膜炎糖尿病 泌尿生殖道功能失调 肿瘤和免疫机能低下者易受B群链球菌感染 临床意义 C G群 溶血性链球菌与化脓性链球菌有相似的毒力因子 引起上述相似的感染米勒链球菌是人体口腔 上呼吸道 消化道 泌尿生殖道正常菌群尽管在化脓性感染病灶中能分离到该菌 但大都是手术和创伤引起的内源性感染 临床意义 肺炎链球菌大叶性肺炎 支气管炎中耳炎 乳突炎 鼻窦炎 脑膜炎和菌血症肺炎链球菌的荚膜在细菌的侵袭力上起着重要作用肺炎链球菌的溶血素 神经氨酸酶也是其主要致病物质 临床意义 草绿色链球菌人体口腔 消化道 女性生殖道的正常菌群 可引起心脏瓣膜异常患者的亚急性细菌性心内膜炎从血液中分离出该菌常被认为是污染的细菌血液链球菌 温和链球菌 格氏链球菌 口腔链球菌 中间型链球菌常分离自深部脓肿 特别是肝和脑的脓肿 三 生物学特性 1 形态 链球菌是直径小于2 m的球形或卵圆形革兰阳性球菌 呈链状排列 链的长短和细菌的种类及生长环境有关 肺炎链球菌呈矛尖状 宽端相对尖端向外 成双排列 无芽胞 无动力 但能形成荚膜和粘液层 2 培养特性 兼性厌氧菌肺炎链球菌和草绿色链球菌某些种需要CO2营养要求高须在培养基中加入血液 血清 最适生长温度35 37 pH7 4 7 6血平板上形成灰白色小菌落不同菌种的菌落可形成 三种特征性溶血现象液体培养基中表现为絮状和颗粒沉淀肺炎链球菌荚膜多糖使菌落呈粘液状产生自溶酶 培养48h后出现 脐窝状 菌落 3 生化特性和抵抗力 发酵葡萄糖和多种糖 不产气 乳酸为代谢终末产物 触酶阴性链球菌基因DNA中G Cmol 为34 46抵抗力本菌属大多数细菌对干燥和消毒剂敏感本菌属细菌较少引起细菌耐药性近年对青霉素耐药甚至多重耐药的肺炎链球菌的出现并在全球播散 引起高度关注 抗原结构 抗原结构复杂多糖抗原位于细胞壁以此可将链球菌分类为A B C D F G等20群蛋白抗原主要有M蛋白 F蛋白和G蛋白等 四 微生物检验 检验程序 二 标本采集 咽拭子 痰液 脓汁和血液等标本采集后在2h内运送到实验室 立即进行检查和接种对B群溶血链球菌的检查 用无菌棉签采集第35周 37周妊娠妇女的阴道分泌物 置于含多粘菌素 10 g ml 和萘啶酸 15 g ml 选择性培养肉汤中孵育18 24h 再作分离培养 三 标本直接检查 直接显微镜检查标本涂片 革兰染色 显微镜检查见链状排列革兰阳性球菌有助于无正常菌群污染标本的诊断荚膜肿胀试验用于检查肺炎链球菌直接检测抗原咽拭标本的A群链球菌和女性生殖道标本的B群链球菌可用抗原检测用凝集试验或用ELISA方法等检测该方法特异性和敏感度高 当标本所含的菌数太少可出现假阴性 四 分离培养与鉴定 用羊血琼脂平板培养有助于识别溶血特性和进一步鉴定初代分离需用5 CO2环境 35 37 孵育24h观察菌落性状菌落周围呈现透明溶血环的为 溶血性链球菌 菌落直径大于0 5mm或小于0 5mm 草绿色溶血环的为 溶血性链球菌 有些菌落灰白色不出现溶血环革兰染色为革兰阳性球菌 链状或短链状排列触酶试验阴性 6 5 NaCl不生长者可确定为链球菌属细菌 链球菌属内的鉴定试验 溶血性链球菌鉴定 溶血性链球菌鉴定Lancefield群特异性抗原鉴定根据Lancefield分群的要求提取各菌落的抗原 与相应的分群血清进行凝集试验 与B群抗血清凝集的菌株可直接确认为无乳链球菌与F群抗血清凝集并且菌落直径 0 5mm可确定为米勒链球菌与A C G群抗血清凝集的菌株不能确定种类 还需根据菌落大小和生化反应进一步鉴定 溶血性链球菌鉴定 PYR试验化脓性链球菌产生的吡咯烷酮芳基酰胺酶水解吡咯烷酮 萘基酰胺 加入N N 二甲氧基肉桂醛试剂后产生桃红色杆菌肽 bacitracin 敏感试验化脓性链球菌为阳性 有别于其他PYR阳性的 溶血性细菌 猪链球菌 海豚链球菌 和A群小菌落 溶血性链球菌 米勒链球菌 此法可作为筛选试验 溶血性链球菌鉴定 VP试验挑取平板上孵育过夜菌落置于2mlVP肉汤中 孵育6h后加入VP试剂 摇匀30秒 出现桃红色者为阳性该试验可鉴别A C G群 溶血的大 小两种不同菌落CAMP试验无乳链球菌能产生CAMP因子 它可促进金黄色葡萄球菌溶血能力 使其产生显著的协同溶血作用本法可作为无乳链球菌的初步鉴定试验 溶血性链球菌鉴定 此外鉴别 溶血链球菌还有BGUR B D葡糖糖醛酸酶试验 C G群菌落为阳性反应 C G群米勒链球菌则为阴性反应 2 非 溶血链球菌鉴定 通过血清学测定抗原群 可将B群链球菌 非 溶血的菌株和肺炎链球菌得以鉴定Lancefield的D群抗原可以存在于牛链球菌 肠球菌属和片球菌属 因此需要进行生化反应予以鉴别 草绿色链球菌鉴定 草绿色链球菌是人体正常菌群一部分 通常不致病 目前借助于常规方法鉴定到种有一定困难 通常将其鉴定到群 根据16SrRNA可分为温和链球菌群 mitisgroup 米勒链球菌群 millergroup 变异链球菌群 mutansgroup 和唾液链球菌群 salivriusgroup 商品化鉴定系统 API Strep系统ID32strep系统Microscan系统 抗链球菌溶素O抗体检测 常用于风湿热的辅助诊断活动性风湿热患者抗体效价一般超过400单位 肠球菌属Enterococus 广泛分布在自然界常栖居在人 动物的肠道和女性生殖道为医院感染的重要病原菌 一 分类 肠球菌属原归类于链球菌属于1984年将其命名为肠球菌属至今 经由16SrRNA序列分析和核酸杂交等 证实肠球菌可分为5群19个种临床标本分离的肠球菌多属于第2群 二 临床意义 肠球菌所致感染最多见于泌尿道感染 是重要的医院感染病原菌多与泌尿道器械操作 留置导尿 尿路结构异常有关腹腔和盆腔创伤时也是常见的感染菌肠球菌引起的菌血症常发生于有严重基础疾患的老年人 长期住院接受抗菌药物治疗的免疫功能低下患者 二 临床意义 近年来不断上升的肠球菌感染率和广泛使用抗菌药物出现的耐药性有关在临床诊断前应认真评估分离菌的临床意义临床标本中分离的80 90 是粪肠球菌屎肠球菌约占5 10 很少分离到肠球菌属的其它种 三 生物学特性 形态 肠球菌为革兰阳性球菌 呈单个 成对或短链状排列 琼脂平板上生长的细菌呈球杆状液体培养基中呈卵圆形 链状排列无芽胞和荚膜 个别菌种有稀疏鞭毛 培养特性 兼性厌氧 最适生长温度35 10 和45 均能生长营养要求不高 部分粪肠球菌菌株在含有兔血 马血或人血的平板上出现 溶血 而在羊血平板上不出现 其它菌种出现 溶血或不溶血所有菌株在含6 5 NaCl肉汤中能生长 生物学特性 在40 胆汁培养基中能分解七叶苷 多数菌种具有吡咯烷酮芳基酰胺酶 能水解吡咯烷酮 萘基酰胺 PYR 不含细胞色素氧化酶和触酶但粪肠球菌培养于含血的培养基中 可合成细胞色素或触酶或两者皆有 因而某些菌株表现为触酶弱阳性含链球菌D群抗原 G Cmol 为37 45 抵抗力 对头孢菌素类 林可霉素类和磺胺类抗菌药物耐药近年来获得性耐药菌株不断增多 表现为对氨基糖苷类耐药和对万古霉素耐药 对万古霉素的耐药是由vanA vanB和vanC等基因介导 四 微生物检验 一 检验程序 二 标本采集 常规方法采集血 尿 创伤标本和其他拭子 标本于1小时内接种完毕 三 标本直接检查 涂片染色显微镜检查可见单个 成双或短链排列卵圆形革兰阳性球菌 四 分离培养与鉴定 标本接种于含血琼脂平板若送检标本中含革兰阴性杆菌可选用选择鉴别培养基 常用的有 叠氮胆汁七叶苷琼脂 可抑制革兰阴性菌生长 而肠球菌分解七叶苷产生黑色菌落 哥伦比亚多粘菌素 萘啶酸琼脂 CAN 和苯乙基乙醇琼脂 PEA 由于耐万古霉素肠球菌发生率增高 为早期检出耐药菌株 可使用含万古霉素琼脂筛选方法 详见第三十五章 细菌鉴定方法如下 菌属的鉴定肠球菌属细菌革兰染色阳性 卵圆形 单个 成双或短链排列 触酶阴性 胆汁七叶苷和PYR阳性 6 5 NaCl肉汤中能生长 肠球菌属间的菌种鉴定 根据对甘露醇 山梨醇和精氨酸的代谢分五群第一群 分解甘露醇 山梨糖产酸 不水解精氨酸第二群 分解甘露醇和水解精氨酸第三群 水解精氨酸 不分解甘露醇 山梨醇和山梨糖第四群 不分解甘露醇 山梨糖 不水解精氨酸第五群 分解甘露醇不分解山梨糖 不水解精氨酸 触酶阳性的其它革兰阳性球菌 微球菌属 Micrococcus 巨球菌属 Macrococcus 动球菌属 Planococcus 考氏考克氏菌 Kocuriakristinae 触酶微弱阳性的差异球菌属 Alloiococcus 和粘性罗氏菌 Rothiamucilaginosa 这些菌属细菌在人体和动物体表广泛存在 常在临床标本中分离到 一般认为是非致病菌 偶尔在某些免疫抑制或缺陷的患者中引起机会感染如心内膜炎 脑膜炎 肺炎等 微球菌属 以往曾将葡萄球菌属 微球菌属 口腔球菌属和动球菌属共同归类为微球菌科 细菌为革兰阳性 直径为1 1 8 m的球菌 常成对 四联或呈不规则排列在大多数临床标本中由于形态与葡萄球菌属相似 触酶阳性而混淆 本菌属氧化酶阳性 对杆菌肽敏感 呋喃唑酮耐药可以与葡萄球菌属区别 差异球菌属 是需氧的革兰阳性球菌 成对或簇排列 触酶试验弱阳性 氧化酶试验阴性 常在中耳炎患者的标本中