microRNA 的研究进展(整合版)

MicroRNA的研究进展 microRNA生物学特征及功能 microRNA的加工成熟 microRNA的作用机制 microRNA应用现状 目录 1 2 3 4 5 展望 1 microRNA的生物学特征及功能 RNA的分类 1 信使RNA mRNA 2 转运RNA tRNA 3 核糖体RNA rRNA 4 核酶 ribozyme 和其它RNA自我催化分子 5 基因组RNA genomeRNA 6 指导RNA guideRNA 7 非编码RNA 8 tmRNA 9 小胞质RNA smallcytoplasmicRNA scRNA 10 小核RNA smallnuclearRNA snRNA 11 核仁小RNA smallnucleolarRNA snoRNA 12 反义RNA antisenseRNA 13 端粒酶RNA 14 小RNA 小RNA分子本身又包含了若干类RNA 根据小RNA的生成 结构和功能大约可分为以下三类 miRNA microRNA siRNA smallinterferingRNA 其他小RNA micoRNA miRNA 是广泛存在于真核生物中的一组短小的 不编码蛋白质的RNA家族 它们是由19 23个核苷酸组成的单链RNA 3 端可有1 2个碱基长度的变化 microRNA的生物学特征 microRNA广泛地存在于多种真核生物中 从低等生物到人类都有其存在的痕迹 其生物学特性主要表现为 高度保守性 时序表达特异性和组织表达特异性 以及miRNA独有的特征 高度保守性microRNA的序列结构在各个物种间具有高度的进化保守性 最具有microRNA保守性的是let 7 它广泛存在于两侧对称的生物体中 其序列保守性令人吃惊 科研人员认为 microRNA的保守性具有重要的生物学意义 提示在不同生物发育过程中 microRNA具有相同的调控机制 同时也为生物早期进化同源性提供了某种依据 时序表达特异性在不同组织 不同发育阶段中 microRNA的表达水平有显著差异 一些microRNA呈时间发育特异性表达 NeilsonJR等研究表明在细胞发育的不同阶段mRNA表达是动态调控的 AsonB等研究发现 不同物种间许多microRNA表现高度保守性 mRNA表达变化越大 生理差别越大 物种间的差别最主要是由于microRNA表达的异时性变化和较小程度的空间表达差异 由此 可以推测microRNA表达的变化可能在动物发育过程中形成生理差别是其作用 组织表达特异性一些microRNA表达具有细胞和组织特异性 如miR 17 20位于Hela细胞同一基因簇内 并在斑马鱼细胞中表达 但在鼠肾和蛙卵巢细胞中未检测到 这种特异性对microRNA的调控功能有重要意义 miRNA独有的特征 其5 端第一个碱基对U有强烈的倾向性 而对G却有抗性 但第二到第四个碱基缺乏U 一般来讲 除第四个碱基外 其他位置碱基通常都缺乏C miRNA执行一定的生物学功能 对与其互补的mRNA表达水平具有调节作用 通过两种机制调节靶基因的表达 1 结合到靶mRNA3 端非翻译区 3 UTRs 抑制其翻译 2 像siRNA作用一样结合到靶上并降解靶mRNA 一些偏大的miRNA 27nt 可能参与了基因组的重组 参与生物的发育与多种生理 病理过程 2 microRNA的加工成熟 miRNA的生成需要两个步骤 1 由长的内源性转录本 pri miRNA 经Drosha酶作用生成70nt左右的miRNA前体 pre miRNA 该过程发生在细胞核2 将pre miRNA经Dicer酶作用加工为成熟miRNA 该过程发生在细胞质中 microRNA的加工成熟 首先由基因组转录形成长链RNA分子 pri miRNA Pri miRNA经双链RNA核酸酶Drosha酶作用 加工形成70 100nt长度的pre miRNA Pre miRNA在Exportin5介导作用下转运出胞核至胞质中进行下一步加工 Pre miRNA在胞质中经双链RNA核酸酶Dicer酶作用加工形成单链成熟miRNA分子 3 microRNA的作用机制 miRNA对靶基因的作用机制一直是众多研究人员的关注热点 最早发现的两个miRNA lin4和let 7被认为是通过不完全互补结合到靶基因mRNA3 UTR 以一种未知的方式抑制蛋白翻译 进而抑制蛋白合成 阻断mRNA的翻译过程 后来的研究也发现 多个果蝇miRNA和它们的靶基因mRNA的3 UTR存在部分同源 但由于有miRNA与其目标靶之间的互补是不完全的 用生物信息学的方法鉴定miRNA的目标靶位点并非易事 在植物中 由于miRNA与潜在的靶基因是完全互补的 使得植物的miRNA靶预测相对较容易 但这些预测基因是否就是miRNA的靶基因 还需要作进一步验证 microRNA 研究表明 microRNA基因是一类高度保守的基因家族 按其与靶基因的作用模式不同 主要可分为以下三种类型 1 作用时与靶基因完全互补结合 作用方式和功能与siRNA非常类似 最后切割靶mRNA 常见于植物 2 作用时与靶基因不完全互补结合 进而阻止翻译而不影响mRNA的稳定性 这是目前发现最多的作用模式 常见于动物 3 具有以上两种作用模式 当与靶基因完全互补结合时 直接靶向切割mRNA 当与靶基因不完全互补结合时 阻止靶基因的翻译 microRNA miRNA对靶基因的调控 正如前所述 pre miRNA由exportin 5输出至胞浆中 然后释放pre miRNA pre miRNA与Dicer互补结合 产生长度为22nt的不完全配对的双链RNA dsRNA 双链中的一条为成熟的miRNA 另一条则为它的互补链 最后 双链中成熟的miRNA与RNA诱导的RISC结合 随后与靶mRNA互补 而互补链没有结合RISC 因此在体内是趋于降解的 对miRNA来说 发挥对靶基因的调控作用 Dicer和RISC是必不可少的 因为Dicer是产生miRNA不可或缺的 而RISC则是miRNA实现功能的载体 microRNA miRNA介导的RISC简称miRISC miRNA containingRNAinducedsilencingcomplex 也被称作miRNA核糖核蛋白复合体 miRNP miRISC复合体除了包括成熟miRNA外 还包含Dicer蛋白和多种其他相关蛋白 其与RISC结合的原理与siRNA类似 以dsRNA为例 当双链中两根支链的稳定性相似或相同时 它们结合进入RISC的概率也相似或相同 因此称为等势结合 当双链中支链的稳定性相对较弱时 解旋酶会从稳定性弱的一支解开dsRNA 从而会偏向性地产生一条结合到RISC复合体上 这类结合称为优势结合 未进入RISC的互补链RNA会很快降解 3 1RNA诱导沉默复合体 RISC 的形成 RISC是miRNA参与靶基因调控过程中不可或缺的载体 在miRISC复合体中 Dicer对pre miRNA的处理与双链螺旋的解旋是偶联进行的 通常 只有一条链进入miRNA 具体选择双链中哪一条链取决于碱基热动力学稳定性因素等因素 不进入RISC的miRNA链被称之为伴随连 passenger 并被冠以星号 具有更低的稳定性 通常情况下被降解掉 但在某些情况下 两条链均具有活性 成为针对不同靶基因mRNA的功能miRNA RISC是具有多轮催化效应的酶 在这一过程中 其核心组分Ago2发挥重要作用 因此 在组成miRISC的蛋白质中 Ago蛋白家族成员在RISC功能中处于中心地位 3 1RNA诱导沉默复合体 RISC 的形成 Ago家族蛋白为一类分子质量约为100kD的蛋白质 属于进化保守的家族 包含有PAZ和Piwi两个保守的RNA结合结构域 是目前唯一一种在所有RNAi和miRNA通路中均可发现的蛋白 Ago蛋白与miRNA结合使其朝向正确 以便与靶基因mRNA作用 Ago蛋白可能招募其他蛋白行使翻译抑制功能 一些Ago蛋白直接切割靶转录本 Ago蛋白 miRNA靶向互补mRNAs导致目的mRNA切割降解的过程被称为转录后基因沉默 post transcriptionalgenesilencing PTGS 有效的PTGS需要RISC对mRNA转录本的切割 miRNA可以指导RISC在转录后水平下调基因的表达 mRNA的降解或翻译抑制 采取何种沉默方式是由mRNA的特性所决定的 如果mRNA能够与miRNA完全互补 该mRNA就会被RISC特异地降解 如果mRNA不能与miRNA完全互补 仅在某个位点与miRNA互补 那么RISC就不会特异地降解mRNA 只是阻止mRNA作为翻译的模板 使之不能合成蛋白质 3 2miRNA诱导的基因沉默模式及其相关机制的形成 在动物中 多数情况下复合物中的单链miRNA与靶mRNA的3 UTR不完全互补配对 从而阻碍对该mRNA的翻译 并以此来调控基因表达 但不影响mRNA的稳定性 如线虫中的miRNAlin 4就是以这种方式调控它的两个靶基因 lin 14和lin 28的翻译 另一种主要的作用方式则与siRNA诱导的转录后基因沉默的PTGS相类似 当miRNA与mRNA完全互补配对时 Ago蛋白可通过对mRNA的切割直接导致其降解 完成基因沉默调控 3 2miRNA诱导的基因沉默模式及其相关机制的形成 miRNA对翻译起始抑制的相关机制主要有如下一些观点 首先 mRNA可通过抑制核糖体的组装来阻断翻译起始 进而起到对翻译过程的抑制作用 miRNA的抑制作用需要靶mRNA具有m7G帽子结构成为支持这一理论的重要依据 由此推断miRISC可能通过对翻译起始复合物形成抑制而发挥作用 还有一些观点认为 通过影响靶mRNA脱腺嘌呤反应 导致其polyA尾缩短 从而使mRNA与polyA结合蛋白 polyAbindingprotein PABP 受阻进而影响蛋白质翻译的起始 3 2 1miRNA的翻译起始抑制与翻译起始后抑制 研究还表明 一些被miRNA作用后的mRNA可以与多核糖体偶联 这些核糖体在翻译中处于非常活跃度状态 此外 miRNA的抑制作用还可能发生在起始之后 这主要是由于其在翻译过程的抑制作用是通过内部核糖体进入位点 internalribosomeentrysite IRES 而不是依赖mRNAm7G帽子来发挥作用 其他作用方式 比如对新生多肽链的翻译同步降解等目前还没有定论 有待进一步证实 3 2 1miRNA的翻译起始抑制与翻译起始后抑制 miRNA可诱导与其不完全配对的靶mRNA衰减 降解 通过Ago蛋白定位于如P小体 processingbodies P bodies 等的RNA颗粒 RNAgranules 中 这些颗粒中包含有mRNA降解的酶 这也可能是miRNA介导Mrna衰减的一个重要途径 3 2 2miRNA介导的mRNA衰减 降解 4 microRNA应用现状 癌症和发育中的miRNA 3 1miRNA功能的发现 过去20年 肿瘤遗传学家揭示了许多与肿瘤多步骤发生及进展相关的基因 这些研究都集中于传统的蛋白质编码基因 包括癌基因 抑癌基因以及维持基因组稳定的基因 在发现miRNA之前 人们一直认为基因组上的部分大片段未被翻译成蛋白质 所谓的 废物碎片 没有功能 而近十年来 越来越多的证据显示 小分子非编码RNA microRNA miRNA或miR 其功能失调与肿瘤发生密切相关 证明了miRNA是基因表达强有力的调控器 证据 基因组计算分析显示约50000个miRNA存在于人类基因组中 每个miRNA在mRNA的3 端非翻译区的相同序列上都有着许多靶结合位点 在已发现的1400多个miRNA中 超过50 的miRNA位于癌症相关的基因组区域内 包括脆性位点 经常发生缺失或复制的区域以及染色体易位的断裂点 例如 miR 125b 1 一种线虫microRNAlin 4的类似物 位于染色体11q24区域 而这一区域在一些肿瘤病人 乳腺癌 肺癌 卵巢癌 宫颈癌等 中的表达常常缺失 Sonoki等的研究认为 该基因与白血病的发生也有关系 越来越多的研究证实 这种长度约22nt的小分子RNA在植物和动物中广泛存在 具有很广泛的调控作用 是高等植物 动物生长发育的重要调节因子 植物miRNA最先于2002年由Reinhart等从拟南芥小分子文库中获得 功能 调控植物形态建成 环境适应性 植物发育进程 3 1miRNA功能的发现 动物机体中miRNA影响胚胎干细胞和多种成体干细胞的发育 胚胎后期发育细胞生长和凋亡血细胞分化 神经元的极性 胰岛素分泌 大脑形态形成及免疫系统的调控 3 1miRNA功能的发现 3 2miRNA在肿瘤诊断中的作用 精确区分不同分化的肿瘤 miRNA的表达具有组织特异性 可将肿瘤与正常组织区分开 并可用于鉴定不明起源的肿瘤 找到原发灶 区分不同分化的肿瘤 以便进行肿瘤亚型的分类 识别肿瘤组织的来源 特别是在临床表现和免疫表型不确定的情况下 miRNA的作用显得格外重要 可作为发现早期肿瘤的非侵袭性分子标记 对肿瘤的诊断及分期有一定的意义 3 3miRNA与肿瘤的发生 miRNA在肿瘤形成过程中扮演着重要的角色 其异常表达与多种肿瘤的发生密切相关 miRNA既可作为抑癌基因 下调原癌基因的活性 也可作为癌基因 下调抑癌基因的活性 作为抑癌基因 部分miRNA在肿瘤细胞中表达下调 当其功能缺失后可导致正常细胞发生恶性转化 miRNA功能缺失的机制包括染色体的缺失 突变 基因沉寂和 或 miRNA形成过程中的改变 3 3 1miRNA作为癌基因 在肿瘤中过表达的miRNA被认为是癌基因 并被称 oncomirs 它们常通过抑制抑癌基因和 或 控制细胞的分化以及凋亡促进肿瘤的生成 在多种不同的肿瘤中发现一些有意义的miRNA过表达 它们均具有癌基因功能 例如 调节myc的miRNAmyc是一个通过调控细胞增殖和死亡 从而调控细胞生长的转录因子 myc经常在人类癌症中突变或放大 miR 155是最早被提到的癌基因之一 位于人类21号染色体BIC基因的第3外显子 此基因不含开放阅读框 过表达可促进细胞异常增殖 在早期白血病形成中会出现靶向性的B细胞过表达miR 155 且经过成熟B细胞恶性转化以后 导致白血病前B细胞单克隆性增殖的过程 后续研究发现miRNA 155在乳腺癌 肺癌 结肠癌和甲状腺癌中均有上调 是一个癌基因 miRNA 21在所分析的实体瘤 乳腺 结肠 肺 胃和内分泌腺 恶性胶质瘤 中唯一表达的miRNA是miRNA 21 与正常组织相比 miRNA 21在癌组织中高水平表达 作为癌基因通过对Bcl2的调节来控制肿瘤的发生 并且可以作为治疗的靶位点 例如 miR 15 miR 16与慢性淋巴性白血病miRNA 15和miRNA 16定位于染色体13q14区段 该区段的局部丢失与慢性淋巴性白血病 CLL相关 在检测的CLL病患中 有近68 的这两种miRNA完全缺失或表达下调 二者都在转录后水平通过靶向作用负调节Bcl 2 其对Bcl 2的抑制诱导了白血病细胞的凋亡 另外 在前列腺癌 外套淋巴细胞瘤和多发性骨髓瘤等肿瘤中也常有该区段的缺失 注 Bcl 2蛋白是一种通过作用于线粒体来抑制细胞凋亡的蛋白 对于癌细胞的存活起着非常重要的作用 3 3 2miRNA作为抑癌基因 目前肿瘤中已完成表达分析及初步功能研究的部分miRNA 3 4miRNA在肿瘤治疗中的作用 miRNA的在体给药局部肿瘤给药 肿瘤内给药是目前miRNA在体给药研究得最多的治疗方式 在多个癌症小鼠模型中 对肿瘤内注射病毒包裹的miRNA已经成功地抑制了其生长 例如 将腺病毒包裹的miR 26a给药到患有肝细胞癌的MYC诱导小鼠中 可有效抑制肿瘤细胞的生长并促进其凋亡 尽管直接注射药物到特定组织 器官中可有效沉默目的基因 组织 器官的特异性及miRNA的半衰期仍然最终决定这些药物的作用强度和时间 但现在已有多种在体肿瘤给药的方式被证实有效 心血管给药心血管给药也是miRNA在体给药研究得较早 较多的领域 在缺血后的心肌重建中miRNA常常发挥重要的作用 研究人员建立心梗小鼠模型 对其进行心肌内注射腺病毒包裹的miR 24抑制剂 注射后发现miR 24表达减少在梗死周围心肌细胞促进了血管生成和血流注减少了梗死区面积 诱导了成纤维细胞的凋亡 一定程度上提高了心功能 肺部给药滴鼻和吸入的方法是使药物到达肺区的简单 便宜 非侵入的方法 肺部支气管 肺泡的结构 都可以直接接受大量细胞进入 肺部粘膜巨大的表面积 能快速发生反应 不会产生肝的首过消除效应 也使得局部给药这种方法在肺部行之有效 通过气管给药 小分子RNA可以实现对哮喘 肺囊细胞纤维化 流感 呼吸道合胞病毒等肺感染性炎性疾病的治疗 泌尿生殖系统给药miRNA类药物可作用于多种泌尿道 生殖系统疾病 局部阴道miRNA脂质体复合体给药 在老鼠体内表现出抑制靶基因和蛋白质的作用 有效地拮抗了单纯性疱疹病毒 膀胱瘤移植小鼠在注射miR 1 miR 133 miR 218模拟物后 肿瘤的生长受到很好的抑制 另外 局部给药还有皮肤 脊髓等方式 且针对miRNA的更多给药方式相信不久后也会开展起来 目前来说 肺部给药研究开展最多 有望最早进入临床中 脑部给药由于解剖上的血脑屏障仍需攻克许多难题 3 3miRNA在癌症预后判断中的作用 Takamizawa等人报道指出 let 7miRNA的表达往往在人肺癌中缺失 而let 7miRNA表达的减少与术后生存期的减短显著相关 此外 let 7miRNA在A549肺腺癌细胞株中的过表达可在体外抑制肺癌细胞的生长 他们的研究结果表明了let 7miRNA表达水平的改变具有潜在临床和生物学作用 Yanaiha