论文哌立福新阻断Akt对食管癌细胞增殖4.doc

哌立福新阻断Akt对食管癌细胞增殖、凋亡影响罗和生，金灵莉，童强，金曙（湖北省武汉大学附属人民医院消化内科，武汉市，430000）摘要 目的：研究不同浓度的哌立福新对食管癌细胞的增殖及凋亡的影响，探讨哌立福新阻断Akt信号通路对食管癌细胞生长的抑制作用。方法：将不同浓度的Akt抑制剂哌立福新加入到人食管癌细胞Eca109中，采用MTT法测定细胞毒性，流式细胞仪测定细胞凋亡率，Western Bloting法检测食管癌细胞中Akt、mTOR、GSK-3蛋白表达。结果：哌立福新对人食管癌细胞Eca109有明显抑制作用并能诱导食管癌细胞凋亡。MTT结果示，随着浓度的升高、时间延长抑制作用增强，并诱导人食管癌细胞Eca109凋亡，呈剂量-时间效应关系；流式细胞术显示，不同浓度哌立福新作用于人食管癌细胞Eca109 24、48、72、96小时后，凋亡率随着时间和浓度的升高而增大，15mol/L作用48小时后凋亡率最大为51.3%；Western Bloting示，Akt、mTOR、GSK-3在人食管癌细胞Eca109中有表达，哌立福新作用后表达显著降低。结论：哌立福新能显著抑制食管癌细胞增殖并诱导其凋亡。关键词 哌立福新; 食管癌；凋亡；增殖；Akt;mTOR；GSK-3 Effects of Akt Inhibitor Perifosine on Proliferation and Apoptosis of Esophageal Carcinoma CellsLUO Hesheng, JIN Lingli, TONG Qiang, JIN ShuDepartment of Digestion,Renmin Hospital,Wuhan University,Wuhan 430000 Abstract Objective:To investigate effects of different concentration of Akt inhibitor perifosine on proliferation and apoptosis of esophageal carcinoma cells。Methods:Eca109 cells were treated with 5、10、15 and 20mol/L of perifosine,respectively,for 24、48、72、96h。The effect of perifosine on cell proliferation was evaluated by MTT assay。The apoptotic rate of the cells treated with 15ml/L of perifosine was detected by flow cytometry,expressions of Akt、mTOR、GSK-3 were detected with Wstern Bloting。 Results:Perifosine had obvious inhibitory effects on the esophageal carcinoma cells and can significantly induce apoptos in does and time-effective manner。 Apoptotic rate of cells treated with 15mol/L perifosine for 48h is the most obvious。Expressions of Akt、mTOR、GSK-3 were high in esophageal carcinoma cells and they were decreased in cells after treated with perifosine。Conclustions:Perifosine can significantly inhibit the proliferation of esophageal carcinoma cells and induce apoptosis。Key words Perifosine; Esophageal carcinoma；Apoptosis； Proliferation;Akt;mTOR、GSK-3食管癌（esophageal cancer）是原发于食管的恶性肿瘤，以鳞状细胞癌多见。世界上食管癌患者以每年30万例的速度剧增，引起了国内外普遍关注【1】。迄今，其确切病因和机制仍不是很清楚。近年来，随着肿瘤细胞生物学和分子生物学研究的不断深入，人们发现食管癌是多因素、多阶段进行性演变的过程，是多种基因变化累积或综合作用的结果，与细胞增殖失控、凋亡减少、细胞周期调控密切相关【2】。哌立福新（Perifosine）是一杂环的烷基磷酸胆碱，是Akt的靶向抑制剂，可与肿瘤细胞膜作用，从而影响肿瘤细胞间生长信号的传导【3】。哌立福新通过降低 Akt的活性，控制众多Akt的下游信号的传递，从而抑制了肿瘤细胞的增殖。有研究表明哌立福新能有效抑制非小细胞肺癌、肾细胞癌、骨髓瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，但其对食管鳞癌细胞的作用少见报道【4-6】。1 材料与方法1.1 材料 1.1.1主要试剂：DMEM培养基（Gibco），特级胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），胰蛋白酶（上海生物制品公司），DMSO、MTT（北京普利莱基因技术有限公司），Annexin V-FITC凋亡试剂盒（贝博生物科技公司），哌立福新（药用粉剂，北京美科美生物有限公司），Akt、mTOR、GSK-3兔多克隆抗体（购自碧云天生物公司），辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔IgG、GAPDH内参（购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）1.1.2主要仪器：恒温CO2培养箱（SanyD，日本），倒置显微镜（OlympusIX-70,日本），酶联免疫检测仪（960，美国），流式细胞仪（Epics XL,Beckman Coulter公司）。1.1.3细胞系：人食管癌细胞株Eca109由武汉大学典藏中心购买。培养基为含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100/ml链霉素的DMEM培养液，培养条件为37、5% CO2培养箱，每2d更换培养基1次。1.2 方法1.2.1 MTT法检测哌立福新对食管癌细胞的增殖的影响取对数生长期的食管癌细胞Eca109，胰酶消化后离心、收集、混匀制成细胞悬液，按每孔510*104个/ml接种于96孔培养板中，每孔200l。37、5% CO2培养箱培养，24h后换液。实验组：加入哌立福新，使终浓度分别达到5、10、15、20mol/L；空白对照组：只加等体积细胞悬液，同时设置本底组为只加不含细胞的培养基；两组均在37、5% CO2条件下继续培养。分别于24、48、72、96h后每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20l，37孵育4h后弃上清，每孔加入200lMTT溶解剂，轻轻振荡10min，使结晶物充分溶解，在570nm波长酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度（A）值，求其平均值。每组浓度、每个时间点设6个复孔。对照组细胞存活率记为100%，实验组按下列公式计算：细胞增殖或毒性=100%*（OD实验-OD本底）/（OD对照-OD本底）1.2.2 流式细胞仪检测凋亡情况实验组：加入不同浓度哌立福新（5、10、15、20、30mol/L），空白对照组：只加等体积细胞悬液，37、5% CO2继续培养。分别培养24、48、72、96h后，胰酶消化、离心、收集悬浮细胞，弃去培养基。用冷PBS洗涤细胞2次，用400l 1Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1106cells/ml。向悬液中加入5lAnnexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8避光条件下孵育15min。加入10lPI后轻轻混匀于2-8避光条件下孵育5min，1h内用流式细胞仪检测。1.2.3 Western Bloting检测Akt、mTOR、GSK-3表达 各实验组经不同浓度哌立福新处理48h后，收集细胞，4预冷PBS洗涤2次，每510*106个细胞加入500L细胞蛋白裂解液，4振荡 20 min，4 14 000 r/min 离心 15 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度。将含等量蛋白质的样品与2上样缓冲液以 11 的体积比混合，100变性5min，经8%-10% SDS- PAGE蛋白电泳分离后电转移至PVDF膜上，以含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭 2 h，分别加入Akt、mTOR、GSK-3兔多克隆抗体，4孵育过夜，TBST洗涤10min，3次。加入辣根过氧化物标记抗兔 IgG抗体，室温孵育 2 h，TBST洗涤10min，3次。ECL化学发光法，暗室曝光。选用GAPDH作为内参，1500稀释。观察Akt、mTOR、GSK-3蛋白的表达。1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件，结果以表示。多组间采用随机单位组设计资料的方差分析（two-way ANOVA），P 0.05认为有统计学意义。2 结果2.1 MTT测定结果 哌立福新对食管癌Eca109细胞有抑制作用。520umol/L的哌立福新作用于Eca109细胞24、48、72、96h后，可抑制细胞的生长，且其对Eca109细胞具有时间和浓度依赖性。见表1。 表1 哌立福新对食管癌Eca109细胞增殖、抑制作用（，n=6）浓度（mol/L） 药物作用时间 24h 48h 72h 96h0 0.8320.126 0.8030.177 0.7370.172 0.5580.1155 0.6750.110 0.6460.138 0.6210.127 0.5210.11110 0.5320.106* 0.5050.183* 0.4730.082* 0.3860.150*15 0.4790.142* 0.4640.180* 0.3790.096* 0.1560.104*20 0.2700.008* 0.2680.127* 0.1670.099* 0.0580.034*表注：与空白对照组比较 *P0.05 *P0.012.2 Western Bloting 检测蛋白表达结果 食管癌Eca109细胞中Akt、mTOR、GSK-3有表达，经不同浓度哌立福新处理后表达下调。如下图1。 a b c d e f图1 不同浓度的perifosine对Akt、mTOR、GSK-3蛋白表达的影响 a.对照组 b.5mol/L c.10mol/L d.15mol/L e.20mol/L f.30mol/L2.3 FCM检测结果Eca109细胞分别经0、5、10、15、20、30mol/L哌立福新作用24、48、72、96h后行流式细胞仪分析，不同浓度比较有显著差异。见表2、图2表2 不同浓度哌立福新对食管癌Eca109细胞凋亡率的影响浓度（mol/L） 细胞凋亡率（%） 24h 48h 72h 96h0 3.011.32 4.403.50 4.512.38 5.991.025 3.861.70 7.002.40 5.631.65 6.172.08*10 7.311.93 11.703.61* 7.792.15 * 8.751.22*15 10.602.56* 20.304.03* 10.403.88* 15.201.98* 20 14.201.66* 21.802.76* 10.601.51* 17.401.73*30 20.302.18* 51.305.83* 31.405.70* 45.801.69* 表注：与空白对照组比较 *P0.05 *P0.013讨论蛋白激酶B(Akt)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,为Akt/mTOR信号转导通路上游的的信号分子,参与调控细胞内若干程序性信号转导，并将其转至靶基因和靶细胞,从而抑制细胞凋亡、促进细胞周期进程和促进细胞增殖等,在介导肿瘤发生发展的信号转导事件中起重要作用。这在卵巢癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌、滤泡状甲状腺癌、恶性黑色素瘤中都有Akt 的过度表达【7-10】。活化的Akt可激活下游的mTOR，其直接磷酸化mTOR的Ser2448位点，激活mTOR,mTOR和它下游途径控制着细胞增殖和转化所需要的特殊mRNAs的翻译。mTOR直接促使4E-BP1磷酸化，消除eIf-4E、4E-BP1之间的相互作用，降低4E-BP1对eIf-4E的亲和力，随之解除它对翻译起始的抑制。mTOR磷酸p70s6k，使它的活性上升100倍左右。p70s6k是核糖体40S小亚基S6蛋白激酶，而S6可以提高含5-TOP mRNA这一类mRNA的翻译效率，从而显著促进蛋白质的生物合成【11-13】。GSK-3是Akt重要的下游因子之一，其肽链结构中富含丝、苏氨酸的残基。在S期，GSK-3水平最高，促进胞核细胞周期蛋白cyclinD1的磷酸化。从而加速了细胞周期。在凋亡早期，Akt磷酸化GSK-3（糖原合成酶3）拮抗-CAT（-catenin）的降解，胞浆中-CAT积聚进入细胞核内与淋巴细胞增强子/T细胞因子作用启动转录过程，上调cyclinD1，调节周期蛋白激酶抑制物P27KIPI、P21CIPI，从而促进细胞周期进程【14】。Frame等【15】的研究表明，GSK-3除了调节糖代谢，还参与肿瘤细胞的增殖与凋亡，细胞骨架的稳定性和血管生成。另外，Demarchi等【16】研究发现，GSK-3可直接磷酸化NF-B系统的组成成分，从而增加NF-B的活性，故可上调NF-B介导的基因表达进而促进细胞的增殖。Ougolkov等【17】和Shakoor等【18】研究了GSK-3与胰腺癌与结直肠癌发生发展的关系，进一步证实GSK-3通过NF-B的介导，起到促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡的作用。本研究中MTT法检测提示，浓度为5-20mol/L的哌立福新对食管癌Eca109细胞增殖均有抑制作用，随着浓度的增加、时间的延长，抑制作用越明显，与空白对照组比较差异有显著性意义（P0.05）。流式细胞仪检测结果示，经过不同浓度哌立福新处理后，凋亡率呈时间、浓度依赖性，48h、15mol/L时凋亡率最大，最大凋亡率为51.3%。表明哌立福新可诱导Eca109细胞发生凋亡。Western Bloting法结果示：Eca109细胞中高表达Akt及其下游信号蛋白mTOR、GSK-3，经过不同浓度哌立福新处理后，这些蛋白表达含量均降低。本实验表明哌立福新对人食管癌细胞株Eca109的生长具有明显的抑制作用并能诱导其凋亡，为肿瘤治疗提供了一个新的靶点。深入揭示和了解 Akt 作用的细胞机制,有可能为肿瘤的基因治疗、抗肿瘤药物的开发提供新的作用靶点,并为了解Akt非特异性和特异性抑制剂在肿瘤治疗的不同阶段的效果提供分子基础。参考文献【1】陆楷，王文敬，P53蛋白在食管癌的诊断中的应用，综述，现代医学仪器与应用，2008,20（1）：18-20【2】赵守华，赫捷，食管癌早期诊断的研究进展，综述，肿瘤，2008,28（2）：177-179【3】Pier Luigi Tazzari,Giovanna Tabellini,Synergistic Proapoptotic Activity of Recombinant TRAIL Plus the Akt Inhibitor Perifosine in Acute Myelogenous Leukemia Cells,Cancer Res 2008; 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