质粒DNA的提取、纯化和电泳检测.doc

质粒DNA的提取、纯化和电泳检测姓名 学号 同组人 班级 实验时间摘要：质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA，它是基因工程中一种非常重要的载体。质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。碱变性提取法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。本次实验利用碱变法对E.coli DH5受体菌中质粒pUC19的DNA进行提取、纯化和电泳检测，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化及琼脂糖凝胶电泳技术。通过此次实验，我们达到了预期效果。关键词：质粒DNA、碱变性提取法、质粒DNA的纯化、DNA凝胶电泳1.引言质粒是细菌细胞中与主染色体共存、可自主复制的一段大多数呈环形的DNA。细菌质粒的相对分子质量大小从1kb至200kb以上不等。一些质粒永远独立于染色体之外，另外一些质粒在一定条件下会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。由于质粒分子小、便于分离和提取的特点，在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，因此质粒是基因工程中一种非常重要的载体。质粒特征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。近年来由于基因芯片技术的出现，质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展，所以这就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。因此，质粒DNA的提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱裂解/碱变性法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的，适用于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶pH值不同。在pH12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；质粒DNA的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当用pH值4.8的KAc（或NaAc）高盐缓冲溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如EB染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面六个因素：（1）样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与分子量（所含碱基）的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。（2）DNA分子的构象：分子量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA（cccDNA）的一条链断裂，变成开环DNA（ocDNA）分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA（Liner DNA）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型（cccDNA）迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状（ocDNA）分子。（3）琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度愈低，则凝胶孔径愈大，DNA电泳迁移速度越快，即分子量越大，选用的凝胶浓度应越小。（4）电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比。电压愈高带电颗粒泳动愈快，但随着电场强度增加，高分子量DNA的泳动速率以不同幅度增加，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减小，为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V/cm。（5）电泳缓冲液: 在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。电泳缓冲液的作用：维持合适的pH。电泳时，正极发生氧化反应（4OH-+4e-2H2O+O2），负极发生还原反应（4H+4e-2H2），长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的pH保持基本不变；使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.010.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化；电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为12mM，目的是螯合Mg2+等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。电泳缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率，当电泳液为无离子水（如不慎在凝胶中忘记加缓冲液，即误用蒸馏水配置凝胶），溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下（如错用10电泳缓冲液），导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。（6）温度：DNA在琼脂糖凝胶电泳中的行为受碱基组成和凝胶温度影响不明显。不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在430内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0.5时凝胶很脆弱，最好在4下电泳以增加凝胶强度。2.材料和方法2.1 材料和试剂实验材料：E.coli DH5受体菌（生长在LB固体培养基）、有Amp标记的质粒pUC19实验试剂：LB液体培养基、氨苄青霉素（Amp）母液（储存浓度100mg/mL）、溶液、溶液、溶液、TE缓冲液、Tris饱和酚、氯仿/异戊醇混合液、酚/氯仿/异戊醇（PCI）（25：24：1）混合液、3M NaAc溶液、冰乙醇、70%乙醇、RNase A、灭菌双蒸水ddH2O、50TAE缓冲液、10mg/mL溴化乙锭（EB）溶液、6上样缓冲液（6loading buffer）、琼脂糖、Supercoiled DNA Ladder Marker、pUC19、pUC19/Hind实验仪器：接种环、三角瓶、天平、红盖瓶、酒精灯、恒温振荡培养箱、100mL离心管、1.5mL塑料离心管、4离心机、涡旋振荡器、微量移液器、不同型号枪头、制胶板、制胶槽、样品梳、电泳仪、紫外灯、微波炉、灭菌锅、恒温水浴锅、记号笔、盛冰的搪瓷杯、离心管架、手套2.2 方法2.2.1 E.coli DH5（pUC19）菌体培养（1）用Amp母液和LB液体培养基配制LB+Amp（Amp工作浓度为100g/mL）液体培养基。（2）用酒精灯灼烧且冷却后的接种环在LB固体培养基上挑取E.coli DH5单菌落，将接种环伸至LB+Amp液体培养基中，在液体培养基与三角瓶瓶壁交界面处向液体培养基中接种E.coli DH5（pUC19）。（3）将培养基在37、200rpm下振荡培养过夜。（4）从过夜培养基中取1%接种量接种到新的LB+Amp（Amp工作浓度为100g/mL）培养基，将新的培养基在37、200rpm下振荡46小时，最后得到菌液。2.2.2 碱裂解/变性法提取质粒DNA（1）取出一支灭菌的100mL离心管，标记上组号，用天平称量其重量，并记录为W1。（2）向100mL离心管中倒入菌液至距瓶口1/3处，每两组的两支100mL离心管配平。（3）将菌液在4离心机中6000rpm离心5min，弃上清。（4）向菌液中加入5mL溶液，涡旋振荡，将菌液在4离心机中6000rpm离心5min，弃上清。（5）将100mL离心管称重，标记其质量为W2，计算W2-W1。（6）每100mg菌体量，加入（按菌体量接近的重新分组，溶液补平）：1.0mL溶液，充分涡旋振荡，用溶液再次配平；2.0mL溶液，轻柔颠倒混匀，冰浴35min；1.5mL溶液，轻柔颠倒混匀，冰浴5min。（7）将菌液在4离心机中12000rpm离心15min，小心转移上清到新的离心管内，记录体积V。（8）加入2V冰乙醇，颠倒混匀；-20静置15min。（9）将菌液在4离心机中12000rpm离心15min，弃上清。（10）加入5mL 70%乙醇，12000rpm离心3min，吸弃上清。（11）重复70%乙醇洗涤一次，37风干510min。（12）分次加入1mL TE溶液并转移到EP管中，得质粒DNA粗提物。（13）向质粒DNA粗提物中加入5L RNase A（10mg/mL），终浓度为50g/mL，37孵育12小时。2.2.3 质粒DNA的纯化将1mL质粒DNA粗提物分出500L到一新EP管中，使得每组两管。每个EP管进行如下操作：（1）加入等体积的Tris饱和酚，涡旋振荡，12000rpm离心5min；（2）转移上清（上清体积是V1）至新管，加入V1的酚/氯仿/异戊醇混合液，涡旋振荡，12000rpm离心5min；（3）转移上清（上清体积是V2）至新管，加入V2的氯仿/异戊醇混合液，混匀，12000rpm离心5min；（4）转移上清（上清体积是V3）至新管，加入1/10V3的3M NaAc溶液（pH=5.2），再加入2V4（V4=V3+1/10V3）的冰乙醇，混匀，-20保存30min；（5）12000rpm离心15min，弃上清；（6）加入500L 70%乙醇洗涤，12000rpm离心2min，弃上清；（7）重复洗涤一次，吸弃上清，37风干5min；（8）每管加入25L TE溶解沉淀，合并，得50L纯化质粒DNA。2.2.4琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA（1）1%琼脂糖凝胶的制备。配制2L1TAE：取40mL 50TAE，用双蒸水将其稀释至2L。正确组装制胶槽、制胶板、样品梳。取40mL 1TAE至250mL干净红盖瓶中，称量0.4g琼脂糖，混匀，轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾3-4次，至溶液澄清无颗粒。待溶液冷却至60左右，加入20L 1mg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，使EB溶液终浓度为0.5mg/L，混匀后缓缓倒入架好样品梳的制胶槽中，冷却凝固待用（冷却凝固时间要在30min以上）。之后轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳槽中事先加入1TAE电泳缓冲液），即可上样。（2）电泳上样。取2.0L纯化DNA、2L双蒸水、1L上样缓冲液（6loading buffer），用微量移液器吹吸混匀。将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1TAE至高出胶面约1mm。将上述混合好的DNA样品，按照表1顺序，点样到凝胶中。其中第11泳道为对照组，在整个实验过程中没有用RNA酶处理粗提物，其他实验过程不变。（3）凝胶电泳与DNA分离。开启电泳仪电源。选择合适的电压（100-120V）和时间（40min）。将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪负极相连。启动电泳，待观察到负极有气泡升起方可离开。电泳结束，关闭电源，取出凝胶。紫外灯下观察电泳结果，摄片，保存，分析。表1 DNA样品加样顺序泳道123456789样品超螺旋markerpUC19pUC19/Hind1组DNA样品2组DNA样品3组DNA样品4组DNA样品5组DNA样品超螺旋marker样量6L5L5L5L5L5L5L5L6L泳道1011121314151617样品6组DNA样品6组DNA样品（对照组）7组DNA样品8组DNA样品9组DNA样品10组DNA样品pUC19/HindpUC19样量5L5L5L5L5L5L5L5L3.结果在碱裂解/变性法提取质粒DNA中，W1为14.16g，W2为14.26g，W2-W1为100mg。碱裂解法提取质粒pUC19 DNA的琼脂糖凝胶电泳得到的条带情况如图一所示。在溶液中，由于DNA核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。图上方是17个点样孔，DNA条带离点样孔越远，说明DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率越快。图1. 碱裂解法提取质粒pUC19 DNA的琼脂糖凝胶电泳1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17bp3,0492,087图2. Supercoiled DNA Ladder Marker的DNA条带泳道1与泳道9 加的样品是Supercoiled DNA Ladder Marker。Supercoiled DNA Ladder Marker 由 8种超螺旋的质粒DNA 构成，DNA大小分别为：2,087 bp、3,049 bp、3,997 bp、5,026 bp、6,133 bp、8,023 bp、10,085 bp、11,849 bp（如图2所示）。其中2 kbp6 kbp间约以1 kbp递增，6 kbp12 kbp间约以2 kbp递增。每次取6L电泳时，每条带的DNA量约为50 ng，其中5 kbp条带的DNA量约为其他条带的3倍（150ng），显示亮带。此DNA 溶液中已含有1Loading Buffer，可直接上样。1Loading Buffer中含有色素Xylene Cyanol FF（0.01%）以及Bromophenol Blue （0.01%）。在图1中Supercoiled DNA Ladder Marker形成的DNA条带中，可以清晰地看清从下往上6条DNA条带（对应的DNA由小到大），而且从下往上数第4条DNA条带（DNA大小为5026bp）最明亮，而其余2条位置靠上（DNA较大）的DNA条带较不明显。泳道2与泳道17加的样品是质粒DNA，即pUC19，可以起到对照作用。pUC19的DNA是cccDNA，即超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA。在图1中，可以看到泳道2与泳道17对应的电泳图中有一条清晰明亮的DNA条带。泳道3与泳道16加的样品是pUC19/Hind。Hind是限制性核酸内切酶，可以酶切pUC19。Hind酶切pUC19的结果是使超螺旋的共价闭合环状结构的pUC19质粒DNA的链断裂，DNA的链断裂的pUC19迁移速度变慢。但是Hind没有将所有pUC19酶切，因此泳道3与泳道16电泳后会形成两条条带。在泳道3与泳道16对应的DNA带中，图中上面那条较细较暗的条带是Hind酶切后的pUC19，图中下面那条较粗较亮的条带是没有被Hind酶切的pUC19。泳道4加的样品是1组DNA样品。其DNA条带很明亮而且宽。这说明1组样品中DNA含量较高。泳道5加的样品是2组DNA样品，可以看见一条较暗的pUC19 DNA条带。另外泳道11对应的电泳图中也可以看到一条较暗的pUC19 DNA条带。在pUC19对应的DNA条带位置处全班10个组均无明显的DNA条带。泳道6加的样品是我们组（3组）DNA样品。我们的DNA带较明亮，说明提取出的DNA较多。但DNA条带位置没有在pUC19 DNA对应的位置。我们组DNA条带位置比pUC19 DNA对应的条带位置靠下，说明我们组DNA迁移距离比pUC19 DNA大，我们组DNA的相对分子质量比pUC19 DNA小。在pUC19 DNA对应的条带位置上可以看到模糊的DNA条带，产生的原因是因为下面的DNA条带中有些DNA因为迁移速度较慢而使DNA条带拉长。泳道11加的样品是6组DNA样品（对照组）。该样品在实验过程中没有用RNA酶处理，其他实验操作不变。因此该样品中含有大量的RNA，所以在DNA带下方形成大片很宽很明亮的RNA区域。泳道4泳道8、泳道10泳道15在电泳图中都有明显的拖尾现象，而且在电泳图泳带的的中间偏上处都有一条或亮或暗的DNA条带，这是E.coli DH5受体菌的DNA碎片，DNA碎片相对分子质量较大，泳动得较慢，所以形成的DNA条带较靠上。某些点样孔的边缘（尤其是下边缘）出现荧光，泳道4、泳道7、泳道10、泳道12等对应的点样孔下边缘可明显观察到此现象。该现象说明这些提取的质粒DNA中含有较多的蛋白质，蛋白质阻碍了部分DNA泳动，从而在点样孔的边缘形成荧光。另外在这些点样孔下边缘的下方还有一条宽度比点样孔下边缘宽的DNA条带，这是提取的样品中残留的E.coli DH5受体菌染色体DNA产生的DNA条带。4.讨论为获得高纯度的质粒DNA，必须彻底去除杂蛋白、染色体DNA和RNA。在整个质粒提取过程中除去染色体DNA的关键步骤是加入溶液、溶液的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时机。溶液中含有50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl（pH 8.0）、10mM EDTA。加入溶液后溶液变浑浊，可剧烈振荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂。葡萄糖能使菌液密度增加，使大肠杆菌重悬并使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，沉淀菌体的量适宜即可，如果菌体过多，可能会导致溶液无法混匀，细胞裂解不充分。加入溶液重悬要充分，如果细胞没有完全散开悬浮，将会影响溶液裂解细胞，最终导致提取产物中含较多的蛋白质，染色体DNA等杂质。另外葡萄糖可以维持细胞渗透压，防止细胞提前破裂。葡萄糖还可以防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用，而Ca2+和Mg2+是DNase的辅助因子，因此EDTA可避免DNase对DNA的降解作用。Tris-HCl可以提供适当的pH。溶液在离心后要尽可能去除干净溶液含有0.2M NaOH、1% SDS。溶液使用前用10M的NaOH和10%的SDS母液配制，配制时要防止NaOH吸收空气中的H2O和CO2而减弱了碱性。加入溶液时，菌液变黏稠、透明，无菌块残留。NaOH可以使细胞溶解。同时，强碱性使染色体DNA、质粒DNA和蛋白质变性；SDS在加入溶液后起到使蛋白质变性的作用。加入溶液时摇匀一定要轻柔，剧烈会导致基因组DNA断裂；静置时间也不能过长，因为基因组DNA在碱性条件下会慢慢断裂。溶液含有5M KAc 60mL、冰醋酸11.5mL、重蒸水28.5mL，溶液终浓度为：K3M，Ac5M。加入溶液时，会立即出现白色沉淀。溶液中的SDS遇到KAc后变成了十二烷基硫酸钾（PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。SDS和蛋白质结合，钾钠离子置换所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质沉淀了，此外大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。HAc起到中和NaOH的作用，因为长时间的碱性条件下会打断基因组DNA，基因组DNA被打断就无法被PDS共沉淀。同时加HAc可以使变性的质粒DNA复性。该步反应形成的高盐环境进一步加速了这一沉淀。冰浴使反应更充分。加入溶液和溶液后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在涡旋振荡器上剧烈振荡，否则，染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要使试剂与染色体DNA充分利用，又不破坏染色体的结构。之后的实验操作是将菌液在4离心机中12000rpm离心15min，小心转移上清到新的离心管内。上清液中含有大量RNA、断裂的DNA片段和质粒DNA。注意此时沉淀不实，宁愿少吸上清，也不要带入沉淀，因为带入的沉淀在之后操作中无法去除。在使用离心机时，样品放置要对称平衡，否则会严重损害离心机的使用寿命。沉淀DNA通常使用预冷无水乙醇，在低温条件下长时间放置可使DNA沉淀完全。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。TE溶液是pH缓冲液，含有10mM Tris-HCl（pH 8.0）、1mM EDTA，呈弱碱性，有利于保护碱基对，为DNA提供稳定的生理状态。同时TE溶液含有EDTA，EDTA可抑制DNA酶的作用。RNase A是一种广泛应用的核糖核酸内切酶，专一性催化C-U间3-5磷酸二酯键的裂开形成具有2,3-环磷酸衍生物寡聚核苷酸，可以去除残留的RNA。寡聚核糖核苷酸会保存在质粒DNA溶液中，但不影响后续的常规操作。质粒DNA中蛋白质的去除通常采用酚、氯仿抽提。质粒DNA纯化过程中使用酚/氯仿/异戊醇混合液。苯酚是强的蛋白阻断剂，可使蛋白变性析出。同时，Tris饱和酚的pH在8.0左右，此时DNA分布于水相而RNA分布于有机相，从而可分离上清获得DNA。pH为8.0的Tris饱和酚比重略大于水，且与水有很大的互溶性，即酚可以进入水相从而影响后续的酶反应。因此，需要使用氯仿。氯仿也是蛋白阻断剂，但强度弱于苯酚，其主要作用是将同水以极小比例互溶的苯酚萃取出来。如果不加氯仿，残留的苯酚会阻碍酶切反应等，且不利于获得含质粒