单克隆抗体在水产养殖中的应用

书书书动物医学进展，（）：单克隆抗体在水产养殖中的应用李晓莉，张以芳，曾令兵，许映芳，肖晶，童亮（云南农业大学动物科学学院，云南昆明；中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北荆州）摘要：单克隆抗体具有高度特异性、均质性及来源稳定并可大量生产的优点，成为感染性疾病研究、诊断和治疗的一个有力手段。随着单克隆抗体技术应用的深入，其在水产养殖中也发挥了很大的作用。论文简要介绍了单克隆抗体的技术原理，对单克隆抗体在水产病原细菌性疾病、病毒性疾病的诊断以及水产激素、水产药物残留检测方面的研究及应用进行了概述，对单抗在水产方面的基础性研究工作进行了总结，并对存在问题和发展前景进行了讨论和展望。关键词：单克隆抗体；疾病；激素；药物残留；水产养殖中图分类号：文献标识码：文章编号：（）单克隆抗体（，）是由一个细胞分化增殖的子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原决定簇的抗体。这种抗体的重链、轻链及其区独特型的特异性、亲和力、生物学性状及分子结构均完全相同，采用传统免疫方法是不可能获得这种抗体的。与多克隆抗体比较，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，具有高特异性、高纯度、均质性好、亲和力不变、重复性强、效价高、成本低并可大量生产等优点。单克隆抗体在血清学技术、免疫学基础研究、肿瘤免疫治疗、抗原纯化、抗独特型抗体疫苗研制等方面得到了广泛应用。近年来，我国水产业发展迅速，养殖品种日益增多，养殖规模不断扩大，伴随着大规模集约化的养殖模式，各种疾病的暴发、蔓延也使水产养殖企业蒙受了巨大损失，而且我国目前水产动物疫病防控还停留在化学疗法阶段。因此我们必须加快鱼类基础免疫学的研究，促进鱼类病原学、诊断技术和疫苗学的发展，将免疫预防手段引入到水产养殖业中来，单克隆抗体技术的应用为我们提供了一个有效的手段，本文对单抗在水产养殖方面的应用进行了介绍，并对存在的问题及发展前景进行了讨论。收稿日期：基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目作者简介：李晓莉（），女，山东潍坊人，研究实习员，硕士研究生，主要从事鱼类病害以及种质研究。櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙通讯作者李志刚，杨宝兰，姚景会乳酸菌对黄曲霉毒素吸附作用的研究中国食品卫生杂志，（）：徐进，冉陆，杨宝兰乳杆菌抑制黄曲霉孢子萌发的研究卫生研究，（）：朱新贵，林捷几种食品微生物降解黄曲霉毒素作用的研究营养卫生，（）：畅晓渊，刘国荣，李平兰奶酪中抗黄曲霉毒素活性物质产生菌的分离鉴定及抑菌作用中国农业大学学报，（）：张建梅，李国军，谷巍生物脱霉剂对黄曲霉毒素的作用研究中国饲料，（）：犘狉狅犵狉犲狊狊狅狀犎犪狕犪狉犱，犇犲狋犲犮狋犻狅狀犜犲犮犺狀犻狇狌犲狊犪狀犱犅犻狅犱犲犵狉犪犱犪狋犻狅狀狅犳犃犳犾犪狋狅狓犻狀，（犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲犜犲犮犺狀狅犾狅犵犲，犖狅狉狋犺狑犲狊狋犃牔犉犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犢犪狀犵犾犻狀犵，犛犺犪犪狀狓犻，犆犺犻狀犪）犃犫狊狋狉犪犮狋：，：，犓犲狔狑狅狉犱狊：；用于细菌感染性疾病的诊断在海水养殖中，弧菌属的细菌在各类细菌中占有很大的比重，其中又以溶藻弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌优势菌种，是各种海洋动物常见致病菌。应用单抗技术开展海水养殖动物弧菌的快速诊断研究，对于早期确诊并及时控制疾病具有十分重要的意义。夏永娟等在国内首次制备出抗鳗弧菌单克隆抗体，其中的株单抗能显著提高受鳗弧菌感染的牙鲆的存活率，同时可延长受大剂量鳗弧菌（）感染的牙鲆的平均存活时间，而其中的一株单抗保护率达，证明其针对的是细菌的中和性表位。在此基础上，又研究设计以为免疫原制备出抗鳗弧菌独特型单克隆抗体。等也进行了鳗弧菌单克隆抗体的制备和鉴定，获得一株与其他弧菌无交叉反应的单克隆抗体，为该菌的免疫诊断和亚种鉴定提供了基础。宋晓玲等制备了溶藻弧菌单克隆抗体并建立了单抗快速检测溶藻弧菌的检测技术，灵敏度高，与其他弧菌无交叉反应。陈晓燕等对溶藻弧菌脂多糖单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用进行了研究，首次制备了一株鱼类病原溶藻弧菌的的单克隆抗体，该抗体属于识别核心多糖的单克隆抗体，其识别的多糖的位置、分子质量大小与制备的杀鲑气单胞菌（犃犲狉狅犿狅狀犪狊狊犪犾犿狅狀犻犮犻犱犪）核心多糖单克隆抗体识别的多糖的位置和大小相似。池信才等制备了一株大黄鱼病原副溶血弧菌单克隆抗体，并建立了检测副溶血弧菌的双抗体夹心方法，该方法对副溶血弧菌的最小检出量为个，灵敏度高，特异性强，可以用于患病大黄鱼副溶血弧菌的快速诊断。哈维弧菌是海洋鱼类常见的病原菌，此菌引起的大范围发病给养殖业带来巨大的经济损失。郝贵杰等建立了抗哈维弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系并对其特性进行了鉴定，制备的抗哈维弧菌可为哈维弧菌的检测及防治等提供有用的试剂，在此基础上又对抗哈维弧菌脂多糖单克隆抗体进行了制备和鉴定，获得一株特异性单克隆抗体。创伤弧菌（犞犻犫狉犻狅狏狌犾狀犻犳犻犮狌狊）是一种嗜盐弧菌，广泛存在于海水及海产品中，人体可通过生食海鲜或经过肢体破损创口接触海水、海产品而受其感染。庞晓雯对抗创伤弧菌单克隆抗体进行了研究，获得株分泌抗创伤弧菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株和，其中在快速检测创伤弧菌感染方面具有重要意义，为开展海上工作人员遇险后快速准确的检测奠定了试验基础。爱德华病广泛流行于叉尾鲴、鳗鲡、牙鲆及鲤科经济养殖鱼，其死亡率较高，为此，金晓航等制备抗迟缓爱德华菌的单克隆抗体，建立了免疫组织化学法，能够很明确地在鱼患病器官检到病菌，并进一步探明了该菌的致病机理。秦红等又在此基础上对抗迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体轻链可变区基因的克隆及序列进行了分析，为进一步制备基因工程抗体打下了基础。嗜水气单胞菌是养殖及野生鱼、虾、蛙、甲鱼等生物常见的细菌性病原体，可通过受伤的皮肤及伤口感染，并可通过食物链感染人，造成腹泻、败血症等疾病而严重威胁人类健康，是我国沿海地区人群中最常见的致病性弧菌之一。陈瑞等进行了抗嗜水气单胞菌单克隆抗体的制备及初步鉴定，成功获得了一株杂交瘤细胞系，可用于特异性地检测嗜水气单胞菌、建立检测该菌的免疫学方法和以免疫组织化学方法检测出该菌感染的病理标本，该的成功制备也为进一步制备针对该菌的抗独特型疫苗创造了条件。樊海平等对日本鳗鲡体表溃疡病病原菌进行了分离、鉴定及单克隆抗体制备，鉴定该病原菌为嗜水气单胞菌，并制备出株抗嗜水气单胞菌的单克隆抗体，可应用于日本鳗鲡嗜水气单胞菌特异性检测。随着单克隆抗体技术研究的深入，将会有越来越多的病菌抗体被研究并应用于实践，为各种水产养殖中细菌性疾病的预防提供有效途径。用于病毒感染性疾病的诊断各种病毒性疾病一直是水产养殖上的大患，它具有暴发性强、波及面广、治愈率极低等特点，使水产业蒙受巨大损失。而单克隆抗体的出现，为研究预防和治疗病毒性疾病提供了一个新的方向。从世纪年代中期，等研制出虹鳟病毒单抗开始，这一技术及其研究成果也应用于水生动物病毒学研究中。史成银等开展了对虾皮下及造血组织坏死杆状病毒单克隆抗体的快速检测的研究，制备出针对对虾病毒的单克隆抗体，并建立了快速检测法，以强制震荡运动减低了反应对布朗运动的依赖，大大提高了反应速度，并消除了“边缘效应”，提高了试验的精密性。实验还表明，的脱脂奶粉是最好的封闭剂。针对罗氏沼虾肌肉白浊病，刘问，钱冬一等制备了罗氏沼虾诺达病毒（）单克隆抗体，并在此基础上建立了检测罗氏沼虾诺达病毒抗体夹心酶联免疫吸附测定（）法，该方法检测灵敏度李晓莉等：单克隆抗体在水产养殖中的应用达左右，比间接法和核酸电泳法有更高的阳性检出率和符合率，适用于生产中患病虾苗和可疑虾苗的病毒检测。对虾白斑综合征是年开始流行于亚洲地区的危害极大的病毒性流行病，感染对虾的死亡率高达，其病原为白斑综合征病毒（，）。由于的囊膜与靶细胞相互作用从而介导病毒对宿主的感染，因此探明这一机理并进而阻断，成为防控感染的重要途径。王轶南等在获得多种囊膜蛋白单克隆抗体的基础上，成功筛选到两株能够明显中和的单抗，这为进一步应用中和抗体阻断感染提供了工具；同时，应用单抗表明了提纯的可通过与宿主细胞发生特异性结合作用，为明确囊膜蛋白在病毒感染中的作用提供了参考和依据。姜有声等对对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白的单克隆抗体制备及其定位进行了研究，研制出抗的单抗，再利用免疫胶体金技术对病毒蛋白进行定位，结果显示，胶体金粒子位于病毒的囊膜上，说明病毒蛋白位于囊膜上。中华鳖病毒病是制约中华鳖养殖业发展的瓶颈之一，研发中华鳖病毒的检测技术，深入开展病原学和疫苗学的研究已成为鳖病防控的当务之急。朱春华开展了中华鳖虹彩病毒单克隆抗体的制备、特性分析及应用研究，制备出分泌抗中华鳖虹彩病毒特异性单克隆抗体的细胞系，分析了中华鳖虹彩病毒单克隆抗体的免疫生物学特性，建立了能够用于检测中华鳖虹彩病毒的、方法，应用中华鳖虹彩病毒单克隆抗体对蛙虹彩病毒属、株病毒的抗原性进行了初步的比较分析，单抗对中华鳖虹彩病毒抗原高度特异、灵敏，可用于中华鳖虹彩病毒的检测和结构蛋白分析。鲤春病毒血症（，）是鲤科鱼类的一种急性、高致死率的传染病，被世界动物卫生组织（）列为必须申报的疫病之一。邴国霞等制备了鲤春病毒（）单克隆抗体，获得了一株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，经试剂盒测定，杂交瘤细胞为亚类，免疫印迹分析表明株单抗腹水与的分子质量约处蛋白结合，而与正常（鲤鱼上皮瘤细胞）不反应，近一步证实了株单抗是针对的特异性抗体。在水产激素方面的研究及应用鱼类生长激素（，）是由鱼脑垂体分泌的一种单链多肽类激素，是与鱼类生长发育关系密切的最重要的激素之一。它具有促进个体生长发育、调节新陈代谢和提高食物转化率等重要作用，并参与蛋白质、脂肪的合成和代谢；此外，还能调节体内渗透压，使海河洄游型的鱼类适应高盐和低盐环境的转换。大量试验已经证实，外源性生长激素具有与鱼体内天然激素相同的生物活性，对鱼体具有明显的促生长作用，因此从功能上说，鱼类生长激素是一种重要的生长促进剂，具有广泛的开发应用前景。科学家们正在进行鱼类生长激素基因工程方面的研究，希望能通过基因工程的方法大幅度提高的产量，这就迫切需要建立鱼类生长激素快速、灵敏的检测方法。现代免疫学技术的发展为建立快速、灵敏、准确的检测方法提供了可能。邓文涛等分离纯化出草鱼生长激素，建立了分泌抗草鱼生长激素单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并成功建立了既能测定生长激素生物活性、又能测定其免疫活性的酶标受体测定方法。杨锋等建立了草鱼生长激素的单克隆抗体，为人们使用血清学技术定量研究草鱼生长激素提供了可能。对鱼类生长的促进作用是通过丘脑下部刺激鱼的摄食行为和提高饲料转换效率、降低饲料系数等作用来完成的，而这些作用都与鱼类的各消化器官有密切关系，了解鱼类胃肠胰中抗原存在的部位，为进一步研究促进鱼类生长作用机理提供线索和证据。因此，方之平等还做了关于草鱼单克隆抗体对九种硬骨鱼的免疫细胞化学定位的研究，基因工程技术的发展为体外大量生产重组鱼类提供了可能。研究表明，将基因重组注射或投喂到鱼体内后，可以明显刺激鱼苗的生长，因此开展鱼类基因克隆和重组生产的研究，不仅对于鱼类结构与功能的基础研究，而且对于开发鱼类促生长剂均有重要意义和应用价值。陈松林等对我国主要淡水养殖鱼类鲢的克隆、表达载体构建及在大肠埃希菌中表达进行了研究，试验应用技术从白鲢垂体中扩增出全长片段，构建了克隆，构建了白鲢表达质粒将此表达质粒转化（）大肠埃希菌，经诱导后，在转化的大肠埃希菌中检测到蛋白的存在，印迹表明该蛋白带与草鱼单克隆抗体具有强烈的免疫反应，充分证明了获得的重组鲢是具有活性的。鲢鱼表达载体的构建及在微生物中的成功表达，为研究鱼类的结构与功能及大量动物医学进展年第卷第期（总第期）生产鱼类重组奠定了基础。杨学明等分析了革胡子鲶生长激素克隆与蛋白质结构，得到了革胡子鲶生长激素基因的开放阅读框（，）序列，抗原性分析表明，在氨基酸序列中的个区域均可形成优势抗原表位，其结构特点非常适合改造成为重组生长激素疫苗或单克隆抗体制剂加以开发利用。在水产基础方面的研究及应用应用单抗研究鱼类免疫球蛋白结构与功能，以加快鱼类基础免疫学的研究是近年来兴起并迅速发展的一项新的研究方向。在过去十年中，国外一些学者对鱼类白细胞亚群以及分子标记的单抗的制备进行了大量的研究，建立了部分淡水鱼类的单克隆抗体。冯绢等制备了抗紫红笛鲷血清的单克隆抗体，并利用单抗进行了同目不同属、不同目之间部分鱼血清的特异性分析，从而证明鱼类血清在同属不同种之间相似度很高，同目不同属之间相似度较低而在不同目之间相似度极低。血细胞在鱼类机体免疫防御中起重要作用，直接参与鱼类机体非特异性和特异性免疫反应，同时对自身生理变化和外界刺激非常敏感，是反映鱼类健康状况和生活环境质量的重要指标。邢婧等通过研制抗牙鲆红细胞单克隆抗体，研究牙鲆红细胞单抗与种常见养殖鱼类红细胞的交叉反应，发现该单抗能特异地与种鱼红细胞结合，反应稳定，不受红细胞形态和发育阶段影响，为鱼类红细胞在分子生物学方面的研究提供了有利工具。甲壳动物的免疫反应主要依靠吞噬、包囊和凝集，属于非特异性免疫，姚翠鸾等也对甲壳动物血细胞及其在免疫防御中的功能进行了研究。王凡等制备了鳜鱼免疫球蛋白单抗，并对鳜的结构进行分析，认为鳜血清结构可能是以四聚体形式存在的。沈锦玉等开展了银鲫血清免疫球蛋白（）单克隆抗体的研究，试图将单克隆抗体运用于银鲫结构与功能的分析，银鲫体液免疫应答规律的研究，病原诊断和流行病学和血清学调查研究。罗霞等对鳜皮肤黏液样蛋白的纯化进行了研究，对多种免疫球蛋白的纯化方法进行了比较。等报道了鲫鱼卵黄蛋白单克隆抗体的研究进展及应用。冯守明等采用单克隆抗体免疫组化标记等技术，对大菱鲆免疫相关组织中免疫球蛋白（）阳性细胞进行了检测，认为大菱鲆的免疫相关组织（含黏膜组织）具备一定的完成特异性免疫的细胞基础，且不同组织之间的免疫细胞数量存在显著差异。杨金先等制备了分泌抗欧洲鳗（犃狀犵狌犻犾犾犪犪狀犵狌犻犾犾犪）黏膜免疫球蛋白的单克隆抗体细胞株，并对这些单克隆抗体的特性进行了分析，证实欧洲鳗黏膜抗体在抗原性方面有别于血清，成功制备的单抗可用于鳗黏膜免疫球蛋白的检测及其结构和功能分析，为欧洲鳗黏膜免疫的进一步研究提供工具。在单克隆抗体的基础方法方面，等报道了一种纯化单克隆抗体的新方法多通路竞争抗体框并法，可用于单克隆抗体的提纯和微量检测。等进行了利用链霉素生物素分离技术排除在实时免疫荧光测定血清中甲状腺素的基质干扰的研究。在水产品药物残留中的应用水生生物病害的治疗，大多仍停留在药物治疗阶段，但是大量药物的滥用使得水产品中药物残留十分严重。随着人们对食品安全的重视和对农兽药滥用造成危害的认识加深，农兽药残留分析现在已变得更加紧迫和重要。常规的农兽药残留检测一般用气相色谱、高效液相色谱等仪器分析，但该法除需要使用昂贵的仪器设备外，样品的提取、净化、衍生化等前处理步骤相当烦琐，很难适应当前现场简单快速和大批量样品残留分析的要求。要想有效监测农产品的农药残留，必须采取简便、快速、特异、灵敏的检测方法。单克隆抗体在农药免疫分析中的应用，将使上述要求成为可能。国际上已有上百种农药可用免疫分析法检测，且已制成商品化快速检测试剂盒或试低条。目前我国已研制出农药残留酶联免疫检测试剂盒个，胶体金免疫快速检测试纸个，另外研制出高效快速地检测生物毒素的免疫检测试剂盒个和免疫胶体金纸条个；研制出兽药残留酶联免疫检测试剂盒个，其中有些试剂盒已实现产业化，取得了显著的经济效益和社会效益。等制备了亲和力高、特异性强的农药克百威单克隆抗体，其抗体亚类为，亲和力常数为，为，最低检测限为。与克百威降解产物呋喃酚的交叉反应率为，另外几种结构类似的氨基甲酸酯类农药的交叉反应率均小于。为建立克百威简便、快速、特异的免疫检测方法奠定了基础。氯霉素（，）曾作为广谱抗生素广泛应用于养殖业。由于其具有严重的毒副作用，残留于动物性食品中的严重威胁着人类健康，宋巍巍等在制备氯霉素单克隆抗体的基础上，将电化学传感器与固相酶联免疫分析技术相结李晓莉等：单克隆抗体在水产养殖中的应用合，建立快速、高效、准确的检测残留的（碱性磷酸酶）（对硝基苯磷酸）分析体系，从而为动物性食品中药物残留的检测提供有力的技术支持。基于的胶体金微粒免疫色谱快速检测试纸条可特异、快速、简便地检测农药或药物残留，针对水产品中氯霉素残留较高的情况，杨挺等进行了动物源食品中氯霉素残留速测金标试纸条的研制，获得的金标试纸条亲合性好，特异性高，用时短，对虾肉样品的最低检出限为，适用于动物源食品中氯霉素残留的快速检测。恩诺沙星（，）曾因为其抗菌谱广、抗菌作用强、价格低廉等优点，在医学、兽医及水产养殖中很快被普遍使用。但长期用药所产生的不良反应、在动物产品中的残留、耐药性的增加以及在环境中的生态效应等方面已引起广泛关注。赵银丽等通过细胞融合技术制备恩诺沙星单克隆抗体（）杂交瘤细胞株，体内诱生腹水法生产单抗，应用研制残留间接竞争（）快速检测试剂盒（），为动物源性食品中恩诺沙星（）残留的快速免疫学检测奠定基础。己烯雌酚（，）在畜牧、水产养殖业上的广泛运用，许多研究表明己烯雌酚能引发人的癌症，所以国际上对的应用进行了严格的限制，常小斌等利用杂交瘤技术建立了株稳定分泌己烯雌酚单克隆抗体的杂交瘤细胞。无色孔雀石绿（，）或称隐性孔雀石绿，是孔雀石绿（）在生物体内的主要代谢产物和存在形式，是的还原产物，其残留时间更长，危害更大。随着社会公众对水产品安全的进一步关注，世界各国均加强了对违禁使用孔雀石绿的检测和查处力度，其中是主要检测目标物。为此，赵春城等制备抗无色孔雀石绿抗体（包含多克隆抗体和单克隆抗体两种形式），并进行相关鉴定，为建立免疫分析法检测无色孔雀石绿打下基础。呋喃西林（）是硝基呋喃类药物的一种。由于它以及其代谢物均具有很强的致癌副作用，已引起世界各国的高度重视。呋喃类物质在动物体内稳定性较差，而代谢物与组织蛋白结合可以形成稳定的化合物，现在各国均禁止其在畜牧生产上应用，因此对于呋喃类物质代谢物的研究和检测的意义就显得更为重要。等报道了农药呋喃西林代谢物氨基脲衍生物单克隆抗体制备的相关研究。李军平等运用单克隆抗体技术建立了能分泌喃西林代谢物衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并用单克隆抗体建立了检测呋喃西林谢物残留的方法，为商品化试剂盒的组装奠定的了基础。问题与展望单克隆抗体虽然具有很多优点，并在我国的水产事业中发挥了巨大作用，但是仍然存在不少问题。一是目前单克隆抗体目前主要的研究重点是在人体上，对水产品研究相对薄弱，鱼类的免疫特异性错综复杂，总体鱼类免疫机制的研究还很不系统和完善，所以单抗在水产动物体内作用的机理有待进一步深入；二是单