蛋白质的测定方法

蛋白质的测定方法pro 的测定方法分为两大类：一类是利用 pro 的共性，即含氮量，肽链和折射率测定pro 含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定 pro 含量。但是食品种类很多，食品中 pro 含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此 pro 的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出 pro 的含量。由于食品中 pro 含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。一 凯氏定氮法这种方法是1883年 Kjeldahl 发明，当时凯氏只使用 H2SO4来分解试样，来定量谷物中的pro，他只知用 H2SO4分解试样，而不能阐明 H2SO4分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所以只使用 H2SO4分解试样，需要较长时间，后来由 Gunning 加入改进，他改进的办法是在消化时加入 K2SO4使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原来硫酸沸点的380上升到400，提高了不到 67所以速度也就加快了，凯氏定氮法至今仍在使用。我们在检验食品中 pro 时，往往只限于测定总氮量，然后乘以 pro 核算等数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗 pro。1 凯氏常量定氮法：不论常量、半微量以及微量定氮法它们的原理都是一样的，首先第一个步骤是消化：（1）消化：样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的C、H 氧化为 CO2和 H2O 蒸汽逸出，而 pro 则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。（2）在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330，而添加硫酸钾后，温度可达400，加速了整个反应过程。此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。但为了防止污染通常使用硫酸铜。所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。（1）蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。（2）吸收与滴定：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。 1操作步骤：准确称取样品中0.50-2.00g 于500ml 凯氏瓶中加10g 无水 K2SO4加0.5gCuSO4加20ml H2SO4 在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中继续消化30分钟至到样液呈绿色状态，停止消化，冷却加200ml 水连接蒸馏装置用硼酸作吸收液 在 K 氏瓶中加波动珠数粒和80ml50% NaOH 立即接好定氮球 加热至到 K 氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗用0.1N HCl 滴定。计算：N（V2-V1）0.014W总氮量%= （N(V2-V1)0.014）/W 1000.014-氮的毫克当量数pro%=总氮%K乳制品 K=6.38（N=15.7%）小麦粉 K=5.79（N=17.6%）动物胶 K=5.6（N=18.0%）冰蛋 K=6.7（N=14.8% ）大豆制品 K=6.0（16.7%） K=6.25则（N=16% ） K-换称等数各种试剂的作用:浓 H2SO4：A ：脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将 H2SO4还原为 SO2，本身则变为CO2B： 氧化C： pro 与浓 H2SO4生成 NH3，CO2，SO2，H2OD： NH3与 H2SO4生成硫酸铵（1）CuSO4 的作用（催化剂）CuSO4为红色沉淀，当 C 完全消化后，反应停止，红色消失，变为兰色，即为消化达到完全，兰色为 CuSO4的颜色（2）K2SO4 的作用（提高沸点）沸点由330提高到 400加速了反应过程。（3）硒粉和过氧化氢，氧化汞都为催化剂，但为了防止污染通常采用硫酸铜（4）50%NaOH 的作用下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素:（1）K 氏烧瓶和取样量如果称1g 以上的样品，就需要 K 氏烧瓶最小500ml ，8001000ml 的更好，这样的 K 氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好。（2）分解剂A H2SO4和 K2SO4的添加量有机无分解需要 H2SO4量，H2SO4 应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加 H2SO4多，为了提高分解温度，要大量添加 K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分。K2SO4和 H2SO4的添加比例是：1g 样品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml这种比例在国内外都使用，是公认的还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10：20mlB 催化剂用作催化剂的有 Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4 、TiO2，对 Hg，HgO 有毒但结果好，Se 与 CuSO4得到结果是一种，TiO2，的结果偏低，采用不同的催化剂则消化时间不同， HgO 消化麦子为38，Se 与 CuSO4消化麦子55，TiO2消化麦子 70，所以在给出测定结果时要注明催化剂的类型。（3）热源的强度消化时热源的强度同迅速消化和完全氨化关系很大，即便盐类 K2SO4加得多，如果热源弱，也是没有意义的，热源过强导致 H2SO4损失，使氨回收率低，另外 K 氏瓶的容量大小，颈部的粗细和长短等，也与热源的强度有关。（4）氨的蒸馏和吸收及滴定蒸馏有两种:1 直接蒸馏（装置简便，准确性好）2 水蒸汽蒸馏蒸馏加 NaOH 是50%，加的量为 H2SO4量的4倍，硫酸量为12ml，则 NaOH 为124=48ml，而且一般高于这个理论值，即加到5055ml，如果 NaOH 量加的不够就变成 H2S， H2S 是强酸，使颜色变红。吸收液有：1标准 H2SO4 用标准碱返滴定，甲醛红指示剂2 硼酸 用 HCl 进行滴定，混合指示剂目前都用硼酸吸收液，用硼酸代替 H2SO4，这样可省略了反滴定，H2SO4是强酸，要求较严，而硼酸是弱酸，在滴定时，不影响指示剂变色范围，另外硼酸为吸收液浓度在3%以上可将氨完全吸收，为保险期间一般用4%。6实验注意事项a.样品应时均匀的，若是固体样品应事先研细，液体样要混合均匀。b.样品放入 K 氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。c.消化时，如不容易呈透明溶液，可将 K 氏烧瓶放冷后，加入 30%过氧化氢催化剂23ml，促使氧化。d.在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在 K 氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。e.如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。f.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。g.氨是否完全蒸馏出来，PH 试纸检查馏出液是否为碱性。h.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀无。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时 Cu 离子与氨作用生成深兰色的络合物。i.消化剂绿色后继续消化30分钟即可。2 K 氏微量定氮仪法3 K 氏半微量定氮仪法 (2 、 3原理一样)操作方法大同小异，半微量法消化后，定容100ml，然后吸 25ml 蒸馏吸收液吸收。N（V2-V1）0.014W计算总氮%=(N(V2-V1)0.014)/(W10/100)100 对于微量定氮仪法，仪器有了改进，样液称样少，蒸馏消化液也少，其它基本一样。4 K 氏自动定氮法原理与上面一样，仪器，采用 K 氏自动定氮仪：其装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，消化装置：由优质玻璃制成的 K 氏消化瓶以及红外线装置的消化炉。二 水扬酸比色法：1 原理： 样品中的 pro 经 H2SO4消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下与水扬酸钠和次氯酸钠作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm 处比色测定，求出样品含氮量，计算蛋白质含量。2 方法 （）标准曲线的绘制取6个25ml 容量瓶编号 0 1 2 3 4 5 6分别加空白酸液 2ml 分别加磷酸盐缓冲液 5ml稀释至总体体积至15ml 分别加水扬酸钠 5ml37C 水浴 15分钟加入次氯酸钠 2.5ml37C 水浴 15分钟取出试液于660nm 下进行比色，绘标准曲线。（2）样品处理：准确称样0.201.00g于 K 氏瓶中加15mlH2SO4和5g 催化剂电炉上加热到沸腾后加大火力消化直到出现暗绿色时摇动瓶子K 氏瓶全部消化后冷却加水至250ml 容量瓶。（3）样品测定：准确吸取上述消化溶液10ml于100ml 容量瓶中定容准确吸2ml于25ml 容量瓶中加5ml 磷酸缓冲液以下操作与标准曲线绘制的步骤相同并以试剂空白微对照，测得样液的光密度，从标准曲线查出其含氮量。（4）计算CF含氮%= - 100W10001000 C-从标准曲线中查出测定样液的含氮量（Ug ）F-样品溶液的稀释倍数W-样品重量（g）pro%=总氮%K（K 可为6.25，也可查）3注意事项：A 当天消化液最好当天测定，结果重现性好，如果样液改至第二天比色就有变化。B 当在 PH 和试剂适当范围内加入氯源后，颜色的显色和温度有关，应严格控制反应温度。C 这种方法测定结果基本与 K 氏法一致。4 试剂（1）氯标液：称经110干燥2h 的硫酸铵0.4719g于烧瓶中定容10ml 此液1ml 相当于1.0mg 氮标液使用时配制成 1ml 相当于2.50Ug 氮标液。（2）空白酸液：称0.50g 蔗糖加15mlH2SO4和5g 催化剂与样品一样消化定容250ml使用时吸收此液10ml加水至100ml 为工作液备用。（3）磷酸盐缓冲液：称7.1g 磷酸氢二钠加38g 磷酸三钠加20g 三九石酸钾钠加400ml 水溶解过滤另称35gNaOH 溶于100ml 水中冷至室温 缓缓地搅拌加入磷酸盐溶液中加入水稀释至1000ml 备用。（4）水扬酸钠溶液：称25g 水杨酸钠和0.15g 亚硝基铁氰化钠溶于200ml 水中过滤，加水稀释至500ml（5）次氯酸钠溶液：吸4ml 安替富民液，用水稀释至100ml5 仪器（1）分光光度计（2）恒温水浴三 紫外分光光度法1 原理：pro 及其降解产物的芳香环基 ，在紫外区内对某一波长具有一定的光选择吸收，在280nm下，光吸收与 pro 浓度（38mg/ml）成直线关系，因此，通过测定 pro 溶液的吸光度，并参照事先用 K 氏定氮法分析的标准样品，从标准曲线查出蛋白质的含量。2 试剂：（1） 0.1mol/l 柠檬酸水溶液。（2）8mol/l 脲（NH2）2CO 的2NNaOH 溶液。 脲的2N 氢氧化钠液（3） 95%乙醇（4） 无水乙醚3 仪器（1） 751型的紫外分光光度计（2） 离心机4 操作方法（1）标准曲线的绘制：准确称取样品.2.00g，置于50ml 烧瓶中，加入 0.1mol/l 柠檬酸水溶液30ml，搅拌30分钟使其充分溶解，用四层纱布过滤于玻璃离心管中，以每秒钟30005000转的速度离心10分钟，分别吸出上清夜0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml 于6个10ml 容量瓶钟，每个容量瓶，8mol/l 脲的氢氧化钠溶液充分摇2分钟（如果离心再次离心） ，取透明液于比色皿中，在280nm 下测定其吸光度。 （做参比值）以事先用 K 氏定氮法测定的样品中蛋白质的含量微横坐标上面的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。（2）样品测定准确称取试样1.00g于50ml 烧杯中加0.1mol/l 柠檬酸溶液30ml 搅拌10分钟四层纱布过滤到离心管中用8mol/L 脲的 NaOH 溶液定容，摇匀后于280nm 下测吸光度，从标准曲线上查出 pro 的含量。计算： 蛋白质= C/W 100C-从标准曲线上查得的 pro 含量（mg ）W-测定样品溶液相当于样品量（mg）说明：a.此法运用于糕点，牛乳和可溶性 pro 样品，测定糕点时，应把表皮颜色去掉。b.温度对 pro 水解有影响，操作温度应控制在 2030。四 双缩脲法-皮尼克法1 原理：双缩脲在碱性条件中，能与 CuSO4结合成红紫色的络合物。pro 分子中含有肽链与双缩脲结构相似，也呈此反应。本法直接用于测定像小麦粉等固体试样的 pro 含量