chip实验流程.doc

操作要点二、技术总结（一）、关于细胞细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般细胞长到7580比较好。（二）、关于抗体！抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。单 抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中， 很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。（三）、关于交联与超声破碎！这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。一 般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下 15min，1的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器， 那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp1000bp。但是200bp2000bp的范围也是可以接受的。（四）、关于操作希望尽可能的保持低温（4度）。沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。（五）、关于解交联虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。（六）、关于DNA片段的回收需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。另外还有一些，一时想不起来。以后慢慢补充吧。与EMSA相比，优势就是直接研究了体内的情况。EMSA，并不能真实地模拟体内的环境，蛋白分子和核酸分子的浓度也发生变化了，更不用说蛋白分子和核酸分子在细胞内的定位问题。“所谓的EMSA，其实就是在体外，将某一种核酸和某一种蛋白混合在一起，然后看它们是否能相互结合。但是众所周知，体外环境和体内环境是完全不同的。很有可能在体内，这种核酸和这种蛋白由于细胞区域定位的问题，根本不会相遇，也根本不会有结合的事情发生。但是在体外，当它们相遇时，它们却能结合。也有可能在体内，这种核酸和蛋白的浓度相当的低，在这样低浓度的状况下，它们不会结合。但是在体外EMSA实验中，核酸和蛋白的浓度都增加了好几十倍。导致反应向阳性的方向进行，这种情况又该如何解释？所以EMSA结果阳性，是能结合的必要条件，但却不是充分条件。”ChIP结合realtimePCR，基本上还是能相对真实的反映细胞内部转录因子和启动子的结合。但是具体问题具体分析。三、实验设计这里只说说实验各组的作用1.input：样本经过超声，但是没有进行ChIP，包含样本超声后总DNA，可以进行电泳，检测超声效果，同时，可以与最后ChIP样本进行比较，看ChIP的效率（如果用同一引物进行PCR，ChIP组和input组亮度差不多，说明ChIP效率高，基本上，样本中所有的目的基因片段都被ChIP下来了，反之，说明效率低，实验条件有待改进）2、阳性对照：一般用anti-RNA Polymerase II抗体，因为RNA Polymerase II是通用转录因子，在所有细胞中都能结合基因（当然是在该细胞中表达的基因，所以为了保证阳性对照有效，一般选择阳性对照的引物是根据管家基因设计的）的核心启动子区，因此，理论上ChIP后PCR都会有条带3、阴性对照：用普通的IgG做为抗体，理论上不会ChIP下来任何DNA片段，因此作为阳性对照，但是由于非特异结合，或者实验过程中，没发生结合的DNA清除不完全，可能也会出现条带，个人认为这组最理想的结果当然是没有条带，但是如果有一条淡淡的条带（与阳性对照和目的基因组相比），也是不妨碍的。4、实验组，这个就不多说了就是用自己感兴趣的转录因子去检测感兴趣的基因实验细节做ChIP（Chromatin Immunoprecipitation）几个月，时间不长，但深刻体会细节决定成败，把自己认为值得注意的细节总结如下：1、cell counting：尽量做到准确，会影响input结果。2、cross link：甲醛的终浓度是1%，这个基本所有的protocol上都会强调。3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的tip头，在液面下吹打，否则很容易产生气泡，后面的sonication就麻烦了。4、sonication：ChIP中最重要的一部分，合适的条件要自己摸索，可以一次尝试不同次数的sonication，然后建议采用EZ-ChIP上推荐的方法看看sonication的效果如何。5、加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混匀，因为salmon sperm DNA是很粘稠的物质，若不混匀，后面你会发现beads的量不一样，自然也会影响实验的结果。6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽量吸干净，必要时可用gel loading tips吸。7、含beads的samples离心时，有的protocol上推荐是1000rpm，45秒，但可以根据情况调整，但要注意转速不能太快防止beads破碎。（当然如果采用的是magnetic的beads就不存在这个问题）8、reverse crosslink可以是654个小时，也可以overnight。9、reverse crosslink后的在进行下面步骤之前建议先离心，把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。10、每次行real time PCR之前都要把sample离心保证取样的准确。11、110ul的枪取3ul以上才比较准确，所以考虑好自己PCR反应体系的配置。另外补充：1、一个ChIP一般需要34天的时间，其中有几个步骤是可以停下来的：（1）细胞收集：用含蛋白酶抑制剂的PBS洗涤离心，去上清的细胞收集液可置-80冻存；（2）用SDS重悬细胞后可置-80冻存；（3）sonication结束，离心后的上清置新的离心管后可-80冻存；（4）reverse cross-link后的标本可-80冻存。2、agarose beads 的wash过