流感病毒的快速检测方法.doc

流感病毒的快速检测方法一、RT-PCR快速诊断方法（一）生物安全要求（二）病毒核酸提取（三）RT-PCR（四）PCR 产物纯化（五）流感病毒RT-PCR检测引物二、免疫荧光方法检测流感病毒（一）原理（二）标本处理（三）间接免疫荧光法（四）结果判断三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测（一）基本原理（二）实验试剂（三）实验步骤四、快速诊断试剂盒流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。一、 RT-PCR快速诊断方法核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经2530个循环，使DNA产物达到倍增的效果。（一） 生物安全要求生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。（二） 病毒核酸提取1. 实验材料及仪器(1) QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit（Catalog# 74104）(2) -巯基乙醇（-mercaptoethanol）(3) 70% 乙醇(4) 无菌1.5ml 离心管(5) 10l、20l、200l、1000l加样器和枪头(6) 可调14K微型离心机(7) 旋转混合器2. 操作步骤(1) 取1支无菌、无RNA酶的1.5ml Eppendorf管，加入500l RLT。(2) 取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）100l，加入上述Eppendorf管中。(3) 加5l -巯基乙醇，充分混匀。(4) 加600l 70%乙醇，于旋转混合器混匀。(5) 从试剂盒中取出带滤膜的离心柱，并标上标本号。(6) 将第4步的混合液体分两次（每次600l） 吸入于滤柱中，12000rpm 离心15秒，弃收集管中的离心液。(7) 滤柱仍放回收集管上，将第4步的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm 离心15秒，弃收集管中液体。(8) 于滤柱中加入700l RW1，12000rpm 离心15秒。(9) 从试剂盒中取出一支新的2ml收集管，将离心后的滤柱转到新的收集管上，于柱子中加入500l RPE，12000rpm 离心15秒弃收集管中液体。(10) 滤柱放回收集管上，于滤柱中加入500l RPE，1300014000rpm 离心2分钟。(11) 从试剂盒中取出一支1.5ml Eppendorf管，将滤柱转到新的1.5ml管上，于滤柱中加入3050l 无RNA酶的水，室温静置13分钟。(12) 12000rpm 离心1分钟，弃滤柱。收集的离心液即为提取病毒的RNA，可以直接用于逆转录实验，或在-20以下保存，-30可保存34个月。3. 注意事项(1) 试剂盒中的RPE液用前需加44ml无水乙醇，使终体积达到55ml。(2) 所有用过的枪头、收集管放入2%次氯酸钠消毒缸中过夜。（三） RT-PCR1. 一步法 RT-PCR(1) 实验材料1) QIAGEN One Step RT-PCR Kit Cat No 2102122) RNase inhibitor 40u/l（Promega）3) 上游引物 200ng/l4) 下游引物 200ng/l5) 模板RNA（Templet RNA）(2) 实验步骤1) PCR反应配置（在清洁区缓冲间，加RNA模板应在核酸室）无RNA酶水（Rnase Free Water） 28.75l5Buffer 10l10mM dNTP 2l Enzyme Mix 2lRnase inhibitor 0.25l上游引物 1l下游引物 1lRNA 模板 5l 总量：50l2) 将PCR 反应管放入PCR扩增仪3) RT-PCR 反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换，相应的反应条件需要做适当调整。 60 1 min 42 10 min 50 30 min 95 15 min 94 30 sec 52 30 sec 72 1 min 返回第 5部，循环34次 72 10 min 4 保存4) PCR产物检测琼脂糖凝胶配置：用1TBE 将琼脂糖配成1.2%1.5%溶液，加热使之完全溶解。冷却到5060时加入溴化乙锭（Ethidium Bromide EB，10ug/l），终浓度为0.5g/ml。PCR产物检测：将凝胶放入电泳槽,加入1TBE Buffer ，使它淹没过胶面。每份标本取4l PCR产物，与1l 5Loading Buffer 充分混匀后全加入凝胶孔中。于同一凝胶的第一孔加入5l分子量标准样品。加完样后，盖上电泳槽盖子，接通电源，稳压100v，电泳时间约3040min。结果分析：用UV254暗箱式紫外透射仪观察电泳结果，在透射波长254nm 下观察结果效果较好。或者用凝胶成像系统观察电泳结果。5) 注意事项：含EB的琼脂糖经处理后放入科研垃圾袋内统一处理。含有EB的凝胶处理方法： 加1倍体积的0.5mol/L KMnO4,小心混匀。 加入1倍体积的2.5 mol/L HCl,小心混匀。于室温放置数小时。 加入1倍体积的2.5 mol/L NaOH,小心混匀后即可丢弃。2. 二步法 RT-PCR(1) 实验材料1) 逆转录酶：AMV Reverse Transcriptase，Catalog# M5101 Paromeg2) 5RT Buffer3) 2.5mM dNTP4) Rnase inhibitor 40u/l（Promega）5) 上游引物 200ng/l6) 下游引物 200ng/l7) 无RNA酶的水（Rnase Free Water）8) Ex-Taq 酶 5u/l DRR 001A 250u （Takara）9) 10PCR Buffer(2) 实验步骤1) 逆转录反应（在清洁区缓冲间，加RNA模板在核酸提取室）无RNA酶的水 6.8l5RT Buffer 4l2.5mM dNTP 2l上游引物 1lRnase inhibitor 0.2l逆转录酶 1lRNA 模板 5l 总量：20l将上述反应液混匀，42水浴作用1小时。然后94 3min ，放置冰上（下步PCR反应或-20 待用）2) PCR反应配置（在清洁区缓冲间，加cDNA模板应在PCR扩增室）无RNA酶的水 35.5l10PCR Buffer 5l2.5mM dNTP 2l 上游引物 1l下游引物 1lEx-Taq 酶 0.5lcDNA 模板 5l 总量：50l3) 将PCR 反应管放入PCR扩增仪4) PCR 反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换，相应的反应条件需要做适当调整。 94 3 min 94 40 sec 52 40 sec 72 2 min 返回第2部，循环30 次 72 7 min 4 保存 PCR 产物检测：同一步法（四） PCR 产物纯化1. 实验材料QIAquick Gel Extraction Kit Cat No 287042. 操作步骤(1) PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳；(2) 用干净的手术刀切割目的DNA片段，将切下的DNA胶放入1.5ml离心管（切胶在暗箱或紫外透射仪下操作）；(3) 加3倍胶体积的Buffer QG（即100mg DNA胶加300l Buffer QG）；(4) 水浴50 孵育10min，直到DNA胶完全溶解（每隔23min 用旋转混合器混匀）；(5) 加一个胶体积的异丙醇（100mg DNA胶加100l异丙醇）；(6) 从试剂盒 中取出带滤膜的离心柱收集管，并标上标本号；(7) 将上述DNA液吸入带滤膜的离心柱，13000rpm离心1min，弃收集管中废液，再将带滤膜的离心柱放回收集管；(8) 于带滤膜的离心柱中加0.5ml Buffer QG，13000rpm离心1min，弃收集管中废液；(9) 带滤膜的离心柱中加入0.75ml Buffer PE，放置25min，13000rpm离心1min，弃收集管中废液，再将带滤膜的离心柱放回收集管上，13000rpm离心1min；(10) 将带滤膜的离心柱转移到一新的1.5ml离心管上；(11) 于带滤膜的离心柱中加2030l TE（或Rnase Free Water），室温35min，12000rpm离心1min，弃小柱，收集的离心液即为纯化的PCR产物，可直接用于测序。（五） 流感病毒RT-PCR检测引物A型检测引物： 5 CCG,AGA,TCG,CAC,AGA,GAC,TTG,AAG,AT 5 GGC,AAG,TGC,ACC,AGC,AGA,ATA,ACTB型检测引物 5 GGG,ACA,TGA,ACA,ACA,AAG,ATG5 TGT,CAG,CTA,TTA,TGG,AGC,TGH1亚型鉴定引物 5 ACT,ACT,GGA,CTC,TGC,TGG,AAC 5 CAA,TGA,AAC,CGG,CAA,TGG,CTC,CH3亚型鉴定引物 5 ATC,AGG,GAG,AGT,CAC,AGT,CTC 5 ATG,CTT,CCA,TTT,GGA,GTG,ATG,CH5亚型鉴定引物 5 GAG,TGA,AGC,CTC,TCA,TTT,TG 5 GTA,CTT,CTT,GGT,TGG,TAT,TAT,TGT,ACG,TCCH5亚型鉴定引物 5 GGG,TGA,GCT,CAT,GTA,CA 5 YTG,AGT,CCC,CTT,TCT,TGAH5亚型鉴定引物 5 GCC,ATT,CCA,CAA,ACA,CCC 5 CTC,CCC,TGC,TCA,TTG,CTA,TGN1鉴定引物 5 AAG,GGG,TTT,TCA,TAC,AGG,TAT,GGT 5 TCT,GTC,CAT,CCA,TTA,GGA,TCCN2鉴定引物 5 GGA,AAT,CGT,TCA,TAT,TAG,CCC,ATT,G 5 AGC,ACA,CAT,AAC,TGG,AAA,CAA,TGC二、 免疫荧光方法检测流感病毒（一） 原理流感病毒主要感染呼吸道上皮细胞，因此在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原，通过直接检查上皮细胞内病毒特异性抗原即可诊断。（二） 标本处理标本采集最好用负压抽取法收集的呼吸道分泌物。1. 在标本中加入维持培养液至总体积为4 ml。2. 使用吸管吹打悬浮液数次。3. 2000 rpm离心5分钟。4. 保留上清液做培养。5. 用10 ml pH7.2 PBS清洗细胞沉淀，弃上清。6. 用0.5 ml pH7.2 PBS 重新悬起沉淀。（三） 间接免疫荧光法1. 在特富龙涂层的12孔显微载玻片的每个孔上加入10 l细胞悬浮液。2. 用载玻片干燥器干燥载玻片或室温自然干燥。3. 用100%冰丙酮室温10分钟固定载玻片。4. 室温晾干载玻片。5. 每孔加10 l 流感相应亚型的特异性抗体（1:1000）6. 玻片在湿盒中37 放置45分钟。7. pH7.2 PBS洗涤1分钟。8. 室温晾干载玻片。9. 每孔加入10 l 1:20 兔抗鼠荧光素结合物（二抗），及0.1 % 伊纹氏蓝（Evans Blue）做负染。10. 玻片在湿盒中37 放置45分钟。11. pH7.2 PBS洗涤1分钟。12. 室温晾干载玻片。13. 加上盖玻片，加上甘油。14. 在400X 荧光显微镜镜下检查。（四） 结果判断阳性讯号为细胞质内苹果绿色荧光，阴性细胞显示为深红色的细胞质部分。观察到三个以上荧光阳性即可判为阳性。三、 实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测（一） 基本原理实时荧光定量（Real-time）RT-PCR术，是指在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。1. 荧光基团主要有TaqMan荧光探针和SYBR荧光染料(1) TaqMan荧光探针：PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号可被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将与PCR产物杂交形成双链的探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 (2) SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入双链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。2. 相关的几个概念(1) Ct值：C代表CyCle，t代表threshold。Ct值是指反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数 。(2) 阈值（threshold）：PCR反应前15个循环荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是615个循环荧光信号标准偏差的10倍。(3) 基线（baseline）：指PCR反应指数扩增前平均本底荧光信号值，通常取615个循环的平均荧光信号值。(4) Ct值与起始模板的关系：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 （二） 实验试剂1. 引物：A型流感通用引物、H5、H7、H9分型引物2. RT-PCR酶3. RT-PCR反应液4. Taq酶5. 无RNA酶的水6. 阳性对照（非感染性体外转录RNA）7. 阴性对照 8. 无RNA酶的水（三） 实验步骤1. 核酸提取方法同RT-PCR的快速诊断。2. RT-PCR反应体系配置(1) 配置反应体系从试剂盒中取出相应的 RT-PCR反应液、Taq酶，反应液在室温下融化后，2000rpm离心5秒钟。设所需PCR数为n（n = 样本数 + 1管阴性对照 + 1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：试剂RT-PCR反应液Taq酶用量9.8l0.2l计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入n/2颗RT-PCR酶颗粒，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装10l。(2) 加模板在各设定的PCR管中分别加入RNA溶液各10l，盖紧管盖，放入荧光 PCR荧光检测仪内，记录样本摆放顺序。3. RT-PCR反应(1) 循环条件设置程序循环数温度（摄氏度）反应时间（分钟:秒）114230:0021923:003592104530721:004409210603051400(2) 仪器检测通道选择F1通道1) 结果分析条件设定读取F1通道的检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。2) 质控标准阴性对照的检测结果为阴性。阳性对照的Ct值应小于等于28.0。否则，此次实验视为无效。4. 结果判断1) Ct值无数值的样本为阴性样本。2) Ct值30.0的样本为阳性。3) Ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果无