2010基因治疗

钱塘湖春行-白居易,孤山寺北贾亭西 水面初平云脚低 几处早莺争暖树 谁家新燕啄春泥 乱花渐欲迷人眼 浅草才能没马蹄 最爱湖东行不足 绿杨阴里白沙堤,离思 元稹,曾经沧海难为水，除却巫山不是云。取次花丛懒回顾，半缘修道半缘君。,人对了世界就对了,心态决定一切没有你的同意，谁也不能让你觉得自己差人一等.,易中天的十句话,人都是逼出来的”。如果你简单，这个世界就对你简单”。 ：“人生没有彩排，每一天都是现场直播”。 ：“怀才就象怀孕，时间久了会让人看出来”。 ：“过去酒逢知已千杯少，现在酒逢千杯知已少”。 ：“人生如果错了方向，停止就是进步”。,：“人生两大悲剧：一是万念俱灰，一是踌躇满志”。 ：“人生和爱情一样，错过了爱情就错过了人生”。 ：“天下有钱人终成眷属”。要成功，需要朋友，要取得巨大的成功，需要敌人,学会说不,不敢说不的人，往往缺乏实力，他们只怕不顺着对方的意，自己就要吃亏。岂知愈是想讨好每个人的，最后可能谁也没讨好，因为没有人珍视他的“好”，却要加倍地责备他可能的不周到。愈是想对得起每一个人的，愈可能对不起人，因为精神、时间、财力有限，不可能处处顾及，结果服务的水准下降，还是对不起人。就算是他拼老命地应付了每个人，至少对不起了他自己。,这世界上有许多人不会说不，他们或是不敢，或是不好意思。,只有在你表现说“不”的实力时，对方才会感激你说的“是”也只有在你知道说“不”的情况下，才能积蓄足够的实力说“是”。 只有充满自信与原则的人知道说“不”，也只有别人知道你有说不的原则之后，会信任你所说的“不！” 委婉地道出你的苦衷、说出你的原则，必能获得朋友的谅解，赢得对方尊重！,如何快乐,把自己当成自己，把自己当成别人，把别人当成自己，把别人当成别人天下没有白吃的午餐前三十年不要怕，后三十年不要悔,最新的一个中心，两个基本点”,一个中心：以健康为中心，两个基本点：糊涂一点，潇洒一点三个忘记：忘记年龄，名利，怨恨四个有：有个伴，有个窝，有点钱，与几个朋友,如何消除烦恼,1，最好的方法：忙碌2，列出烦恼的事的最坏结果，然后想办法解决它，有的烦恼不能解决就忘记它。3，到大自然中去，去感受大自然的魅力，躺在石头上，任凭清凉的风遍身抚摸。,与其羡慕他人美丽，不如自己展露笑容;与其羡慕他人富有，不如自己改变未来;与其羡慕他人聪颖，不如自己勤奋补拙;与其羡慕他人成功，不如自己厚积薄发;与其羡慕他人顺利，不如自己事事尽心;与其羡慕他人优秀，不如自己日日进步;与其羡慕他人充实，不如自己集腋成裘;与其羡慕他人坚强，不如自己百炼成钢;,云与山的爱情,相望云在远远的天涯飘荡,山在遥远的海角企望,彼此就这样天各一方.云说:那山怎么这么熟悉,看他时很远,想他时很近.山说:这云怎么这么熟悉,看她时心静,想她时心慌.相识云说:我就是这样无忧无虑的乐天派.山说:我就是这样也无风雨也无晴的自然派.云的乐天感染了山,山的自然触动云,山在乐天中感到云并不乐天,云在自然中看到山并不自然,云的乐天中蕴涵着淡淡的愁绪,山的自然中隐藏着默默的追求.相思云还在天涯飘荡,山还在海角企望.当云装点成新娘放出光彩的时候,当云怀着喜悦和希望为人类延续接上一环的时候,苦涩正慢慢地渗入山的脊背.云就是云,山就是山,千百年来就是这样,一条永恒不变的法则,阻滞了天涯海角的情怀.一个在天上,一个在地下.,相慰你从天边飘来,一路寻求心灵上的依靠,你寻得好累好累.山的胸膛就是一张床,请你在这里歇歇脚,做个美美的梦.我是飘来的一首小诗,给你带来清新和愉快,为你卸下沉重的负担,再劝你一句,做人不要太累,太累想偎云睡的好香好甜,嘴角挂着一些微笑,山觉得好轻松好轻松,心里哼着一支古老的歌.歌中溶进了山的心曲,轻轻摇晃着贪睡的云,醒来吧,我的云.想想你能否化作甘霖,浇灌我那干渴的裂岩.睡梦中,云在喃喃呓语,幽幽的呻吟好难好怕哈派苦悲!云不想加重山的负担,让我孤独的去吧,我本就是飘荡的云.相别云在告别,去向天涯,享受那挂在天边的一片孤独.山固执的扯着云的一角,不单要云在这里歇歇脚,来吧,化作花雨,溶进山的缝隙.云还是飘然离去,悄然而去.来得那么姗姗,走得那样缓缓,来时带来了什么?走时携走了什么? 山知道, 云知道,天知道,地知道,1判定基因结构异常最直接的方法是 A PCR法 B 核酸分子杂交 C DNA序列测定 D RFLP分析 C,基因诊断复习题,2不符合基因诊断特点的是 A 特异性强 B 灵敏度高 C 检测对象仅为自体基因 D 易于做出早期诊断 C,3遗传病基因诊断的最重要的前提是 A 了解患者的家族史 B 疾病表型与基因型关系已被阐明 C 了解相关基因的染色体定位 D 了解相关的基因克隆和功能分析等知识B,4目前基因诊断常用的分子杂交技术不包括哪一项 A Southern印迹 B Western印迹 C Northern印迹 D等位基因特异性寡核苷酸分子杂交B,5SNP的实质是 A碱基缺失 B碱基插入 C碱基替换 D移码突变 C,6关于基因诊断的描述错误的是 A可以以DNA为诊断材料 B可以以RNA为诊断材料 C可确定被检查者是否存在基因水平的异常变化 D只能以DNA为诊断材料D,7生殖细胞若发生基因结构突变可引起哪种疾病 A 肿瘤 B 高血压 C传染病D 遗传病 D,8目前法医学中主要应用的基因诊断方法是 A基于Southern印迹的操作 B变性高效液相色谱分析 C基于PCR的DNA指纹技术 DSSCP分析 C,9. 下面不属于基因诊断常用技术的是 APCR-RFLP BSouthern印迹 CRNAi DASO分子杂交C,10. 被称为基因诊断间接方法的是下列哪种 ASouthern印迹法 BPCR法 C基因芯片法 DRFLP连锁分析D,11. 对基因连锁分析描述不正确的是 A可能发生基因重组 B结果更为直接和准确 C遗传标志杂合性所带信息量有限 D 家系成员可能不够完整 B,12目前用于基因诊断的遗传标志不包括下列哪些形式的DNA变异 A单核苷酸多态性 B点突变C限制性片段长度多态性 D短串联重复序列B,13以下不是以核酸分子杂交为基础的基因诊断方法有 A基因序列测定 BDNA芯片 CNorthern印迹 D等位基因特异寡核苷酸探针杂交法 A,14不能用于基因诊断的包括 A器官移植 B恶性肿瘤 C遗传病 D感染性疾病D,二十三章 基因治疗,10大“怪病”困惑医学界,“不眠症”：男童永远无法睡觉超忆症”：记住一生所有事情 “失忆症”：50年记忆瞬间消失“口音综合征”：用外国口音说话抗冻症”：这个人永远不怕冷“音乐癫痫症”：一听音乐就昏厥 “持续性冲动症”：随时处于性亢奋状态“交替失明症”：女孩每周“失明”3天“快乐木偶综合征” “脸盲症”,基因治疗（gene therapy）是指以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗。即通过一定方式将正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。 应用一定的方法将具有功能的外源基因或其它遗传物质导入患者体内，从而使患者由于基因缺陷所致的临床症状得到减轻、代偿或纠正的治疗方案。,基因治疗与常规治疗方法的不同：一般意义上疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病的根源异常的基因本身。 基因治疗是20余年来分子生物学和重组DNA技术迅速发展的结果，这种将分子生物学技术与临床医学，特别是临床治疗学结合的思路一开始便产生了巨大的吸引力，开辟了美好的应用前景。,Martin Cline事件 80年代初美国加州大学洛杉机分校卫生科学中心，血液学和肿瘤学部主任Martin Cline首次对-珠蛋白生成障碍性贫血患者进行基因治疗尝试时遭到人们的非议。但时隔10年，分子生物学飞速发展，改变了人们的思维。 把单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK)和正常人的珠蛋白基因重组转入两名重型地中海贫血患者的骨髓细胞，并经静脉输液注回患者体内，以期确定经遗传修饰的细胞输回人体内造血组织的必要条件和其分布表达情况。,腺嘌呤核苷脱氨酶（ADA）的缺陷会使T淋巴细胞功能丧失，患者免疫功能严重缺陷而早死于反复感染。,首例基因治疗:ADA-缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID),泡泡男孩,1990年9月美国Blaese博士成功地将正常的人的ADA基因植入4岁ADA缺乏症小女孩的淋巴结内，完成世界上首例基因治疗试验。获取患者淋巴细胞，通过反转录病毒将ADA基因转移到激活的T淋巴细胞中，而后再输回患者体内，患儿在十个半月内接受了7次转基因治疗后，并未出现明显的不良反应，临床免疫状况显著改善。停止基因治疗后的半年中，体内T细胞中ADA表达仍维持一定水平。,2007年 Ashanti De Silva21岁，仍生存良好,6岁照片,Anderson-“Father”,A success story,1991年,我国科学家进行了世界上首例血友病B的基因治疗临床试验,目前已有4名血友病患者接受了基因治疗,治疗后体内IX因子浓度上升,出血症状减轻,取得了安全有效的治疗效果。,随后,我国科学家利用胸腺激酶基因治疗恶性脑胶质瘤基因治疗方案获准进入1期临床试验,初步的观察表明,生存期超过1年以上者占55%,其中 1例已超过三年半,至今仍未见肿瘤复发。此外,采用血管内皮生长因子基因治疗外周梗塞性下肢血管病基因治疗方案也已获准进入临床试验。目前,我国已有6个基因治疗方案进入或即将进入临床试验。,一、基因治疗的策略基因治疗方案主要包括将正常基因导入患者特定的靶细胞中表达以弥补基因缺失或突变造成的功能缺陷，或采取特定方式关闭、抑制异常表达基因。 在基因治疗中，外源性功能基因或遗传物质就像临床上使用的药物一样而发挥作用。,第一节 基因治疗的策略和基本程序,基因治疗的基本方式 ：1. 基因置换2. 基因增补 3.基因干预（抑制有害基因表达或过度表达的基因）,1. 基因置换 （gene replacement）,定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。目的：将缺陷基因的异常序列进行矫正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确原位修复，不涉及基因组的任何改变，是最理想的基因治疗策略。,2. 基因增补（gene augmentation）,定义：不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位点额外插入正常的基因，在体内表达出功能正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的，又称基因添加。目前基因治疗多采用此种方式。 类型：（1）在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，不去除异常基因，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；,（2）在原有基因表达水平不足以满足机体需要的情况下，异位过表达来增强体内某些功能。如导入细胞因子基因，以增加病人的免疫能力（增强机体免疫力的基因治疗）。,3基因干预（gene interference）定义：即抑制有害基因表达或过度表达的基因，指采用特定的方式抑制某个基因的表达，以达到治疗疾病的目的。方法：采用反义RNA、核酶、小干扰RNA、肽核酸等来抑制或阻断基因的表达。 靶基因往往是过度表达的癌基因或病毒基因。,选择治疗基因 选择基因治疗的靶细胞 利用载体把目的基因导入到受体细胞表达 治疗基因表达的检测,二、基因治疗的基本程序,1治疗性基因选择和获取 选择对疾病有治疗作用的特定目的基因是基因治疗的首要问题。根据不同的疾病选取相应的治疗基因。 如对于血管栓塞性疾病，可选用血管内皮生长因子基因以刺激侧支循环建立，改善栓塞部位的血液供应。目的基因的获取方法包括：基因克隆；人工合成；PCR扩增；基因组文库等。,2靶细胞的选择 基因治疗需某种易于采集又易于送入患者体内的相当数量的细胞充当转基因的靶细胞。可供选择的靶细胞有两类，一类是生殖细胞，另一类是体细胞。在现有条件下，基因治疗仅限于体细胞，基因型的改变只限于某一类体细胞，其影响只限于某个体的当代。,靶细胞的选择，应考虑以下因素：（1）表现基因缺陷的器官及其位置。（2）细胞较易获得，且生命周期较长。（3）离体细胞容易在体外培养，较易受外源遗传物质转化。（4）离体细胞经转染和一定时间培养后在植回体内仍较易存活。 目前常用的体细胞有：造血细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、淋巴细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、肝细胞和肿瘤细胞等。,1.造血干细胞,2.皮肤成纤维细胞,骨髓中具有高度自我更新能力的、能永久重建的造血干细胞。同时它能进一步分化为其他血细胞，并能保持基因组DNA的稳定。,具有易采集，可在体外扩增培养、易于移植等优点。,肌细胞内的溶酶体和DNA酶含量很低，环状质粒在胞浆中存在而不整合入基因组DNA，能在肌细胞内较长时间保留。,3肌肉细胞,4淋巴细胞,5 肝细胞,6血管内皮细胞,7肿瘤细胞,3利用载体把目的基因导入到受体细胞表达 载体的选择 病毒载体 非病毒载体导入基因的方式 直接体内疗法（in vivo） 即将外源基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。这是最有前途的方法，但目前转移和表达效率低等困难。间接体内疗法（ex vivo） 又称回体法。即在体外将目的基因导入靶细胞内使其高效表达，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使外源基因在体内表达，从而达到治疗的目的。这是目前最常用的方式。,基因治疗的两种途径,载体,目的基因,in vivo,ex vivo,靶细胞,1992年将IL2基因肿瘤坏死因子基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞，再将它注射至病人臀部，3周后切除注射部位与其引流的淋巴结，在适合条件下培养T细胞，将扩增的T细胞与IL2合并用于病人，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消退，2名90%的肿瘤消退，另2人在治疗后9个月死亡。由于携有TNF的TIL可积于肿瘤处，因而TIL的应用提高了对肿瘤的杀伤作用。,在体外培养细胞中，基因转染效率很难达到100%，故需利用载体中的标记基因对转染细胞进行筛选。在较多的表达载体中都有neor（新霉素磷酸转移酶2基因）标记基因存在，若向培养基 中加入药物G418，未被转化的细胞不存在neor标记 基因，细胞不能存活，最后只有转化细胞存活下来。在筛选出转化细胞后仍需检测转化细胞中外源基因的表达状况。,4.外源基因表达的筛检,三、基因转移技术基因治疗必须通过适当（安全、高效）的基因转移技术将外源性基因转移至特定细胞内。目前，基因转移技术有两大类：生物学方法和非生物学方法。 非生物学方法（物理方法和化学方法） 生物学方法病毒学方法,（一）基因转移的非生物学方法 基因转移的物理方法：直接注射法 基因枪法 电穿孔法 基因转移的化学方法：磷酸钙共沉淀法 脂质体转染法 DEAE葡聚糖法,直接注射法 又称为裸DNA注射法。将裸DNA直接注入单个细胞或组织内，分为显微注射法和注射法。 显微注射法DNA转移效率高，准确快速，但转染的细胞数目有限，不适合大量细胞的转染，主要用于转基因动物的制备。 注射法简便，将表达质粒注射入平滑肌、心肌等组织，使目的基因在注射局部得到暂时性表达，但DNA转染效率低，常与电穿孔法联合应用。,定义：又称微粒子轰击法（Partical bombardment)，是一种在高压电极作用下，与微小金颗粒或钨粉结合的DNA，瞬间穿透细胞的细胞膜，进入靶细胞、组织和器官的基因转移方法。 优点：基因枪技术具有操作简捷、安全、有效、不损伤靶细胞原有的结构等优点。 缺点：不易进行内脏器官的在体操作。,基因枪,高压气体基因枪,电穿孔法(电脉冲介导法)定义：将细胞置于高压电场，借助高压短脉冲电流的作用使细胞膜出现瞬间微小的孔隙，这些微孔主要分布在靠近电极的细胞表面，从而提高细胞膜对外源DNA的通透性。DNA分子直接通过这些微孔，或者当微孔闭合时伴随膜组分的重新分布进入细胞质中。优点： 转移效率高，操作简便易行。缺点：外源基因表达持续时间短。,磷酸钙共沉淀法 即将目的基因在CaCl2和NaH2PO4存在条件下，形成DNA-Ca3（PO4）2沉淀混合物，通过细胞的吞饮作用进入细胞，整合到染色体上。 该法目的基因制备比较容易，只需经过扩增后纯化，不必构建复杂的载体，但效率低，只限于体外基因转移。,脂质体liposome： 用人工的方法将磷脂在水溶液中形成一种脂质双层包围水溶液的脂质微球，称为脂质体。,脂质体转染法,脂质分子在水溶液中形成脂质微球时，可将生物大分子（如酶、抗体、核酸等）或小分子药物包裹其中，穿透细胞膜进入细胞。,优点：对细胞无毒副作用，可反复给药。不激活癌基因和产生免疫反应。与基因的复合包被过程容易。DNA或RNA均能得到有效保护。操作简单快速、重复性好。缺点： 转染效率低、表达时间短、容易被血液中的网状内皮细胞吞噬等。,（二）基因转移的生物学方法 主要是利用载有外源基因的缺陷病毒感染受体细胞，这是广泛用于临床的较高效、方便的转基因方法。 病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RNA病毒能整合到染色体等特点。因此病毒载体是良好的基因转运载体。,病毒用作载体时需进行改造：将天然的野生型病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。 其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因，如图所示：,目前使用的病毒载体有反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒等，其中逆转录病毒载体最为常用。,基因治疗用病毒载体的基因组结构,1反转录病毒载体 反转录病毒（retrovirus，RV）适用于作基因转移是源于其特殊的复制方式，逆转录病毒在细胞内经本身的逆转录酶作用首先变成DNA前病毒，然后整合到宿主细胞基因组，用目的基因取代病毒的基因，即可利用其高效感染过程，将目的基因顺利地转入靶细胞。,反转录病毒载体的优点是：携带的外源基因能随机地整合到受体细胞的基因组DNA中，因而能够长久稳定地表达一年之久；细胞宿主范围较广泛；病毒感染细胞的效率非常地高，体外感染培养细胞的效率可达90%。 反转录病毒载体的缺点是：重组产生有感染性病毒的可能；在转导过程中，插入性突变可能产生恶性病变。,2腺病毒载体 腺病毒（adenovirus，Ad）为双链线状DNA病毒，通过受体介导的内吞作用进入细胞内，其外壳在细胞内降解，然后其基因组移位至细胞核，在细胞核中腺病毒并不整合于细胞染色体，而是独立存在。 根据其凝血特性分A-F 6个亚型，其中C亚类的2型和5型腺病毒（Ad2和Ad5）在人体内基本上不致病，可作为基因治疗用载体。,腺病毒载体具有下列优点：重组体稳定，不整合入染色体，无潜在的致癌性；重组体对静止或慢分裂细胞都具有感染作用，可用细胞范围广；病毒滴度高，可达1091011，适宜于临床基因治疗。腺病毒载体的缺点是：不能整合染色体，外源基因只能瞬时表达，不能用于遗传病的基因治疗；重复应用可能会诱发人体较强烈的过敏反应；基因组较大，载体构件较复杂。,3腺相关病毒载体 腺相关病毒（adenoassociated virus ， AAV）是目前已知的动物病毒中最简单的一类单链线状DNA病毒，基因组大小仅5kb，本身是缺损型病毒，需要辅助病毒如腺病毒或痘苗病毒的存在才能进行有效的复制和产生溶细胞性感染。 腺相关病毒载体最大的特点是可以进行位点特异性整合，可定点整合于人类19号染色体长臂的特定区域，这样不仅为外源基因的表达提供了一个固定的环境，也进一步减少了插入突变的可能。,腺相关病毒载体的优点是：无致病性，人类为其自然宿主，安全性高；载体构建简单；外源基因的表达稳定；对非活跃增殖的细胞也能高效表达。 腺相关病毒载体的缺点是：不能插入大于3.5kb的外源DNA片段。,研究人员在AAV中导入能够产生-氨基丁酸 (GABA)的基因。GABA作用于大脑基底神经节STN，减缓或抑制身体的运动治疗帕金森病。研究人员将把产生活性神经化学物质的基因注入这12例患者的大脑中，从而缓解帕金森病人的震颤及其他运动障碍。,单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）载体是对非分裂细胞有天然亲和力的病毒载体，可插入30kb的大片段，其感染的特点是具有向神经性，可在神经细胞中呈隐性感染，因此可作为中枢神经系统靶向的良好载体，适用于神经系统疾病的基因治疗。,4单纯疱疹病毒载体,严重免疫缺陷病（SCID ) 和调节免疫细胞及免疫物质正确形成的几个基因的缺陷有关,四、基因干预可以抑制特定基因的表达,（一）反义RNA 1984年，Izant和Weintraub提出了反义核酸技术（antisence nucleic acid technology）的概念，它是根据核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的一类核酸研究新技术。 即根据碱基互补原理，将人工合成或生物合成的特定互补的DNA或RNA序列，导入靶细胞，形成mRNA-DNA或mRNA-RNA杂交双链，从而抑制或封闭基因的表达，达到基因控制和治疗的目的。,反义RNA技术原理,反义核酸技术包括反义RNA、反义DNA及核酶（Ribozyme），它们通过人工合成和反义表达载体的构建获得。 人工合成：DNA自动合成仪进行合成。,原位杂交,红：被标记的siRNA；蓝：被染色的细胞核；绿色：GAPDH蛋白,左边阴性对照，右边转染了siRNA的细胞，可见绿色减少,反义RNA技术在基因治疗中的应用策略 利用反义RNA技术对体外培养的细胞基因表达调控通常采用的方法有两种：一是体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。另一种是构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用但是，当进行体内基因治疗时，因为存在专一性和降解两大技术难题，因此这两种方法都很难应用。,反义RNA技术在基因治疗中的应用前景 目前对反义RNA基因治疗作用的研究多集中在抗病毒感染和抗肿瘤治疗中： 1在病毒感染中的应用 在抗病毒感染中治疗中，反义RNA可在转录阶段抑制病毒的增殖，从而达到抗病毒的目的。如：治疗巨细胞病毒(CMV)所导致的视网膜炎的反义核酸药物(Vitravene)己首先获得FDA批准上市。 2 在肿瘤治疗中的应用 用反义RNA来抑制癌基因的表达或自分泌生长因子的分泌或封闭其受体可能会是一条行之有效的治疗途径。,优点：安全性高：反义RNA只作用于特定的RNA分子，并不改变所调节基因的结构。反义RNA无论怎样修饰，最终在细胞内都将被降解，不留残渣。设计和制作方便： 反义RNA可通过体外转录得到，成本低、纯度高。具有剂量调节效应：反义RNA剂量越大，抑制靶基因的能力越强。,优点及存在的问题：,存在的问题：肿瘤是一种多基因遗传病，单一癌基因的反义阻断并不能完全抑制或逆转肿瘤生长，如果明确某种肿瘤发生中的几个关键癌基因，用几种反义RNA同时抑制或许会收到更好效果。反义RNA在机体内的特异性或靶向性也是目前基因治疗中的一个关键。反义寡聚核苷酸的代谢问题，目前使用的反义寡聚核苷酸及反义表达载体都存在体内迅速失活的问题，特别是人工的寡聚药物，虽然也合成了一些耐降解的类似物（如硫代磷酸核苷），但最终效果均不如人意。,安德鲁法尔,克雷格梅洛,2006年诺贝尔生理医学奖：RNA干扰和基因沉默技术,（二）RNA干扰,RNAi是转录后基因沉默 ( Post- transcriptional gene silence, PTGS ) 的重要方式，也是机体抵御外在感染的一种重要保护机制，由于可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，RNAi正在功能基因组掀起一场真正的革命，并将彻底改变这个领域的研究步伐，因此被science评为2001年最重要的成果之一。,2.RNAi的应用及存在的问题,应用：研究基因功能的新工具；开展基因治疗的新策略。存在的问题：目前siRNA导入胞内的效率低下；如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为siRNA的模板，序列的选择原则尚不清楚；目前RNAi机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的研究报道不多。,第二节 基因治疗的临床应用现状,目前全世界约有400个基因治疗方案处于实验室研究和临床试验之中，少数方案已用于临床。基因治疗的主要病种为恶性肿瘤、神经系统疾病、遗传病、感染性疾病（如艾滋病）和心脑血管病等。,3.理性期：1996至今,临床试验数目,资料截止2012,基因治疗现状国家分布,（资料截止2012）,China 1.3% (n=23),基因治疗现状试验阶段,（资料截止2012）,基因治疗现状疾病种类,（资料截止2012）,基因治疗现状基因种类,（资料截止2012）,基因治疗现状载体种类,（资料截止2012）,中国第一例基因治疗,1991年12月 上海,研究结果：血中凝血因子 IX 水平升高，症状缓解,人凝血因子 IX基因,皮肤成纤维细胞,患血友病 B 的9岁和14岁男孩,评价：中国第一例成功的基因治疗，是世界第二例,逆转录病毒载体,复旦大学遗传学研究所 & 长海医院,薛京伦教授,中国视角-1,世界首个上市的基因治疗产品,中国视角-2,深圳赛百诺公司,一、用正常基因替代错误基因治疗遗传病 起初的基因治疗是瞄准单基因的遗传病，由于目前的技术水平还不能对突变基因在体内进行原位修复，故常用的方法是导入与突变基因同源的正常基因，当缺陷的基因被转入的正常基因纠正后，细胞就会得到生长优势，而未接受转基因的细胞则被自然淘汰。,如：-地中海贫血原因： -珠蛋白表达失衡，导致溶血性贫血治疗靶细胞 ：造血干细胞载体 ： 脂质体、反转录病毒、腺相关病毒,由于肿瘤患者的种类和数量众多，缺乏有效的治疗手段，预后差，因此对基因治疗这类新型疗法的临床应用有很强的迫切性，故肿瘤基因治疗成为当前基因治疗的热门课题，目前大多数的基因治疗临床项目是肿瘤基因治疗。,二、对恶性肿瘤的基因治疗,1、抑制和杀伤肿瘤细胞自杀疗法：导入特定的基因（TK基因），将特定的药物（GCV）转变成有毒的代谢产物，后者能杀死正在分裂的细胞，产生肿瘤特异的药物敏感性。 抑制癌基因的表达：关闭癌基因的表达可以使肿瘤细胞生长减慢。抗肿瘤血管生成：VDGF,EGFR是非小细胞肺癌的治疗靶位,40%80% NSCLC患者中EGFR高表达,特罗凯(盐酸厄洛替尼 ),易瑞莎(吉非替尼 ),针对EGFR的小分子抑制剂,酪氨酸激酶抑制剂,恢复抑癌基因的功能通过基因转染的方法将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞，使之表达正常的抑癌基因产物，可以在一定程度上抑制肿瘤的恶性表现。研究较多的是p53、Rb基因、MTS基因（多肿瘤抑制基因，其表达产物P16是迄今为止所发现的人类第一个最直接抑制肿瘤发生的细胞固有成分）和nm23基因（抑制肿瘤转移的基因）。治疗已发生的肿瘤；防止肿瘤的转移。,中国视角-3,上海三维生物公司 胡放总裁,溶瘤病毒特异地在肿瘤细胞中复制 并杀死肿瘤细胞,溶瘤病毒,ONYX-015 和 H101,缺失E1B55kDa,不影响宿主细胞 p53,正常细胞,野生型 p53,肿瘤细胞,突变型 p53,病毒不能复制,病毒复制后 裂解细胞,2、肿瘤细胞的基因修饰 导入细胞因子基因 导入MHC基因和共刺激分子基因 通过转基因将某些细胞因子如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、TNF和G-CSF基因、组织相关抗原基因和共刺激因子B7等外源基因转入肿瘤细胞，提高其免疫原性，从而使肿瘤细胞更易被机体的免疫系统杀灭。,3、调节和增强机体的免疫功能 细胞因子基因导入免疫细胞：直接调节免疫细胞的免疫功能，可将IL-2或TNF基因转入肿瘤侵润淋巴细胞（TIL）再输回体内，使TIL细胞聚集到癌变病灶，表达IL-2或TNF，形成局部高浓度的IL-2或TNF而杀死肿瘤细胞，避免全身使用TNF时的不良反应。,三、感染性疾病的基因治疗,一些严重危害人类健康的感染性疾病，如HIV、HBV都是基因治疗的研究对象。 研究的方向是破坏病毒的基因组或基因表达的调控途径，常采用特异的反义核酸或RNA干扰技术来封闭病毒结构蛋白的mRNA，以特异抑制或阻止病毒基因的表达。,第三节 基因治疗的问题与前景,1外源基因在人体内的表达调控 哺乳动物细胞中基因表达调控的机制尚未完全阐明，如何使外源基因的表达随体内生理信号的变化而得以精确调控，在目前尚未完全明了。 2导入基因的持续表达问题 解决方法：开发、采用寿命较长的靶细胞，如造血干细胞、骨髓前细胞 3导入基因的高效表达 解决方法：把高效启动子构建入逆转录病毒的载体中，使导入的基因高效表达。,4 靶向性 将目的基因特异性地导入靶细胞，即靶向特异性是另一个重要的问题，这对在体外准确选择混合细胞群体中的某一亚群细胞进行基因转导特别重要，又是将来体内对靶细胞的直接转基因的基因治疗的必要条件。 目前主要思路是根据不同靶细胞的表面标记或受体，设计相应的分子（如抗体或配体），与病毒载体包膜相连，或与逆转录病毒外套上的细胞受体结合形成镶嵌分子，重导逆转录病毒载体的趋嗜性。或采用脂质体的方法进行靶向输送。,5 安全性 外源性基因的整合是否会导致宿主基因失活？癌基因激活？目前仍未发现明显的副作用，但1992年发现三只猴在逆转录病毒转移中发现了恶性淋巴瘤，其原因为污染了辅助病毒。故在操作时应十分小心。此外，若在体内表达大量原来不存在的蛋白质，可能会导致严重的免疫反应。,载体的安全性,负面报道-1,1999年9月 美国,研究结果：患者 4 天后死亡,鸟氨酸转氨甲酰酶 (OTC) 基因,患OTC缺陷病的 18 岁男孩,评价：第一例正式报道的基因治疗死人案,University of Pennsylvania,腺病毒载体,动脉注射至肝脏,死亡原因：腺病毒违规操作，引起强烈免疫反应,Jesse Gelsinger,“Human Gene Therapy Science Under Fire”,2000年1月类似的研究被中止,评论文章Circulation. 2000;101:e9023-e9024,载体的安全性,负面报道-2,2002年法国,研究结果：10 例有效, 3 例治愈2 年后 3 例患白血病,IL-2RG/c基因,11位 X-SCID 患者,逆转录 病毒载体,原因： 逆转录病毒插入激活LMO-2基因