与中储粮交流会

2017年4月,2017年度首次交流会,目录,2,1、手洗法,一、面筋检测方法讨论,步骤：1） 称量：称量待测样品10g，准确至0.01g，置于100ml烧杯中，记录为m1。2） 面团制备和静置：用玻璃棒不停搅动样品的同时，用移液管一滴一滴的加入4.6ml5.2ml氯化钠溶液（2%浓度）。拌合混合物，使其形成球状面团，注意避免造成样品损失，同时粘附在器皿璧上或玻璃棒上的残余面团也应收到面团球上。注意：面团样品制备时间不能超过3min。3）洗涤：将面团放在手掌中心，用容器中的氯化钠溶液以每分钟约50ml的流量洗涤8min，同时用另一只手的拇指不停地揉搓面团。将已经形成的面筋球继续用自来水冲洗、揉捏，直至面筋中的淀粉洗净为止（洗涤需要2min以上，测定全麦粉面筋时应适当延长时间）。,一、面筋检测方法讨论,当从面筋球上挤出的水无淀粉时表示洗涤完成。注意：前面的操作应该在带筛绢的筛具上进行，防止面团损失。4）排水：将面筋球用一只手的的几个手指捏住并挤压3次，以去除在其上的大部分洗涤液。再将面筋球放在洁净的挤压板上，用另一块挤压板压挤面筋，排除面筋中的游离水。每压一次后取下并擦干挤压板。反复压挤直到稍感面筋有粘手或粘板为止（挤压约15次），也可以采用离心装置排水，离心机转速为6000r/min5 r/min，1分钟。5） 测定湿面筋的质量：排水后取出面筋，放在预先称重的表面皿或滤纸上称重，准确至0.01g，湿面筋质量记录为m2。6） 测试次数： 同一个样品左两次试验。,2、机洗法,一、面筋检测方法讨论,步骤（全麦粉）：1）调整面团的混合时间为20s，洗涤时间为5min。2）称样及制备面团：称取两份10.000.01g全麦粉样品于两个预先湿润的88um的洗涤杯，分别加入2%氯化钠溶液4.2 ml5.2ml，将洗涤杯放置仪器固定位置上，启动仪器，搅拌20s使全麦粉和成面团，然后仪器自动进行洗涤，2min后仪器自动暂停。3）取下洗涤杯，在水龙头下用冷却水流小心地把全部已经部分洗涤的含有麸皮的面筋，转移到另一个筛孔孔径为840um粗筛网的酰胺洗涤杯中（建议把两个洗涤室口对口且细筛网的洗涤室在上，进行转移）。在放回仪器固定位置上，继续洗涤3min。大约需用溶液250 ml280ml。,一、面筋检测方法讨论,4） 离心，称重：洗涤完成以后，将湿面筋从洗涤室中取出，确保洗涤室中不留有任何湿面筋。将面筋分成大约相等的两份，轻轻压在离心机的筛盒上。启动离心机，离心60s，取下湿面筋，并立即称重（m1），精确至0.01g。注意：如果离心机有衡重体，可以不必将面筋分成两份。5）测试次数：同一份样品应做两次试验。步骤（小麦粉）：1）调整面团的混合时间为20s，洗涤时间为5min。2）称样及制备面团：称取两份10.000.01g小麦粉样品于两个预先湿润的88um的洗涤杯，分别加入2%氯化钠溶液4.2 ml5.2ml，将洗涤杯放置仪器固定位置上，启动仪器，搅拌20s使小麦粉和成面团，然后仪器自动进行洗涤。,3）仪器自动按5056ml/min的流量用氯化钠溶液洗涤5min，自动停机，卸下洗涤杯。大约需用溶液250 ml280ml。4）离心、称重同全麦粉,一、面筋检测方法讨论,一、面筋检测方法讨论,关注点：,一、面筋检测方法讨论,1、方法研究,二、呕吐毒素检验方法讨论,1）放射性免疫分析法在放射性免疫分析中，最早也是最常使用的标记物是I125，它标记抗体或抗原的方法有两种，第一种是标记具有酪氨酸侧基的蛋白质。在氯胺T 或乳糖过氧化酶-H2O2 存在下，NaI125 和蛋白质的酪氨酸侧基反应， I125 置换芳香环上的氢，形成安定的标记化合物，反应式如图 1 所示。,二、呕吐毒素检验方法讨论,优点：（1）很高的检测灵敏度，可达 10-17mol/L。 （2）因为很少受到干扰，所以信号稳定。 （3）放射性标记物体积小，受空间位阻影响小，生物活性受影响小。缺点：（1）放射能的危险性：由于放射性污染的危险性。因而其输送、储藏、使用均有严格的法律限制，同时放射性废弃物的处理更是麻烦。 （2）放射性同位素的不稳定性：这是放射性免疫分析法的最大缺点。I125 的半衰期只有 59.4 天，因而其标记蛋白质实际的储存寿命只有数周至二个月。无论使用多么稳定的放射性同位素进行标记，也必须每天测定工作曲线且一段时间后必须重新标记。 （3）放射性测定前，游离型标记蛋白质必须除去，不利于实现自动化。,二、呕吐毒素检验方法讨论,2）酶标记免疫分析法 因为在检测中不需要引进发出信号的化合物，只是在反应后生成可发出检测信号的物质。使它成为一种取代放射性免疫分析的一种分析工具。它的原理是无信号的基质在酶的催化作用下发生显色（或发光）反应，其生成物的浓度正比于酶的浓度。通过测量生成物的浓度，即得到酶标记蛋白质的浓度。,二、呕吐毒素检验方法讨论,这些标记物标识蛋白质的方法主要是采用架桥试剂，如下图所示几种。,二、呕吐毒素检验方法讨论,从整体上来说使用该法进行测定时酶的活性及其被标记物的活性极易受标记反应的影响，同时酶的活性极易受温度、pH、及溶液中的离子浓度（Zn2+、Mg2+、N3-）等的影响，所以测定的灵敏度及精密度大部分情况下不如放射性免疫分析法。,二、呕吐毒素检验方法讨论,3）化学发光免疫分析法化学发光分析法与荧光分析法之间的主要区别在于荧光需要激发光，而化学发光不需要激发光。应用的化合物主要有：氮蒽类衍生物，虫荧光素及与之相对应的荧光素酶，环芳基酰肼，稳定的二乙氧烷和草酸衍生物。其发光原理以氮蒽类衍生物为例说明，如下图 所示。,二、呕吐毒素检验方法讨论,化学发光免疫分析法，特别是使用 Acridinium 衍生物作为标记物的化学发光免疫分析法与酶免疫分析法相比具有更高的灵敏度。但化学发光也存在一定的缺点。尤其是它的发光不稳定，容易受外界环境的影响，例如 pH 和温度。当溶液的 pH 改变时，不但发光量子收率降低，而且光谱最大波长也可能发生变化位移。,二、呕吐毒素检验方法讨论,4）荧光免疫分析法 荧光化合物在荧光标记，高效液相色谱柱前及柱后衍生化、DNA 分析、流动细胞计数和免疫分析中都有广泛的应用。比较重要的荧光化合物有荧光素和罗丹明及它们的衍生。荧光素和罗丹明衍生物具有较高的荧光量子产率和结构稳定性，但它门在免疫分析中的灵敏度只有 10-10M 左右， 这主要是受以下几方面的限制： （1）背景荧光干扰大。生物分子在 350 600 nm 多有强荧光信号，与常规荧光化合物的发射光谱相互重叠。导致方法灵敏度剧烈下降，另外许多多相测定材料都有一定的背景值。,二、呕吐毒素检验方法讨论,（2）光散射的干扰。来源于仪器和样品（包括 Tyndall，Rayleigh，Raman现象）的杂散光严重影响测定结果。 （3）淬灭现象。外界环境的变化，例如 pH，极性，含氧水平和与其它重原子或吸收基团靠近等等，都会引起荧光强度的变化。 （4）Stoke 位移小。一般荧光化合物的 Stoke 位移约为 2450nm。这使散乱光及固相材料的影响更加严,2、主要方法对比,二、呕吐毒素检验方法讨论,1）快检卡胶体金免疫层析法,胶体金法检测原理,操作简便、快速,可实现现场筛查,灵敏度较低，其无法给出准确的定量结果,均一性较差，易出现假阳性和假阴性,二、呕吐毒素检验方法讨论,1）快检卡荧光定量法,荧光定量法检测原理,二、呕吐毒素检验方法讨论,1）快检卡荧光定量法,荧光定量法检测原理,操作简便、快速,可实现现场筛查,灵敏度略低，均一性略差,二、呕吐毒素检验方法讨论,2）酶联免疫分析方法,酶联免疫（ELISA）法检测原理,灵敏度较高、线性范围较宽,结果相对比较准确，能给出定量结果,操作相对繁琐，检测时间较长,实验结果的重复性与操作人员的熟练程度密切相关,一次检测样本量要求比较多，不能随到随检,二、呕吐毒素检验方法讨论,4）不同方法学性能对比,二、呕吐毒素检验方法讨论,5）工厂检验方法介绍酶联免疫法,二、呕吐毒素检验方法讨论,1、样品制备 粉碎并取5.0g有代表性的样本置入100mL具塞三角瓶中，加入25mL去离子水与其混合；于振荡器上剧烈振荡10分钟，转速为150r/min；取液体于4000r/min离心5min(或静置3min，再用定量滤纸过滤)；取上清或滤液1mL，再加入4mL去离子水，振荡5S或手摇匀, 取50L进行分析。2、检测步骤： 1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（2025）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 2、 加标准品/样本：加标准品/样本50L/孔到对应的微孔中，再加入呕吐毒素酶标物50L/孔，最后加入呕吐毒素抗试剂50L/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25避光环境中反应30min。,5）工厂检验方法介绍酶联免疫法,二、呕吐毒素检验方法讨论,3、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液250L/孔，充分洗涤45次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。 4、显色：加入底物液A液50L/孔，再加底物液B液50L/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25避光环境反应15min。 5、测定：加入终止液50L/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。,5）工厂检验方法介绍HPLC,二、呕吐毒素检验方法讨论,1、样品制备 准确称取5.0g粉碎的样品，加入5g聚乙二醇8000，并与25mL水混合，以均质器高速搅拌提取2min或振荡提取30min，用快速定性滤纸过滤， 并用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用。2、亲和柱净化 3mL柱管去掉上方塞子，安装上转接头，将转接头另一端与20mL针筒固定后使用；将1mL柱管上方堵头取出后斜剪断，再插回柱子上。 准确移取上述滤液，注入针筒中，调节针筒压力使其以1滴/2秒的速度缓慢通过免疫亲和柱；用20mL