2014-免疫学检验与临床应用

免疫学检测原理及临床应用,郭 继 强,新乡医学院免疫学教研室,免疫学检验是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术，在疾病的诊断、疗效评价中应用广泛。,细胞水平检测,第一节 免疫学检验原理,基因水平检测,分子水平检测,一、免疫细胞的检测,对机体参与免疫应答细胞进行分离、纯化、鉴定、计数及功能测定。,外周血单个核细胞的分离（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC) T细胞和B细胞的分离 DC、NK、M的分离,密度梯度离心(Ficoll)离心,（泛影酸葡甲胺-聚蔗糖）,E花环沉降法 ：分离T细胞（CD2-绵羊红细胞）尼龙毛柱分离法 ：分离T或B细胞（B细胞尼龙毛的粘附力）。贴壁法：分离M,利用细胞的吸附特性,利用细胞表面标志,T细胞：CD3，CD4，CD8,B细胞：CD79，CD19，CD5,NK：CD56+、CDl6,DC：CD11c，CD86,M：CD11b，CD86，CD83,亲和版结合分离法,流式细胞术（Flow cytometry，FCM）,采用激光作为激发光源；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析。,流式细胞仪工作原理,细胞1,细胞2,Ag1,Ag2,流式细胞仪常检测的细胞特性,流式细胞术技术分析,免疫磁珠分离immunomagneticbeads,磁珠抗体,免疫磁珠分离的正选法和负选法,抗原肽-MHC四聚体分离技术,亲和素,抗原肽,MHC I,生物素,荧光素,淋巴细胞的功能检测,淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定,T淋巴细胞增殖试验,1. 原理：,淋巴细胞,DNA合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细胞浆扩大,空泡,核仁明显,核染色质疏松,淋巴细胞转化的刺激物,非特异性刺激物： PHA -T细胞 ConA -T细胞 PWM -T、 B细胞 LPS -B细胞特异性刺激物： 异种抗原 同种组织抗原,形态学检查法,2. 方法：,细胞浆，增大，可见空泡；细胞核增大，偏一侧，核松散，可见核仁。,核仁,3H-TdR掺入法,T细胞杀伤功能测定,细胞毒试验51Cr(铬)释放法,CTL,+,MTT实验 MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比,MTT增殖实验,MTT增殖实验结果,吸光度,细胞数,体内试验,特异性抗原皮肤试验抗原：结核菌素（OT）植物血凝素（PHA）,二、B细胞功能检测,B细胞增殖能力的试验溶血空斑试验B细胞抗体形成功能的检测体内试验,(一)B细胞增殖能力的试验,细菌脂多糖,B细胞增殖,形态学,3HTdR掺入法,(二) 溶血空斑试验,1. 原理：,脾脏,绵羊红细胞,绵羊红细胞,3临床应用与评价,溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。,酶联免疫斑点Enzyme Linked ImmunoSPOT,1.ELISPOT技术起源与发展,1983年, Czerkinsky&Sedgwick ：计数分泌抗体的 B 细胞；1985年，More：NC板，改进显色底物，不再需要琼脂糖凝胶;1988年，Czerkinsky et.al.: 首次将应用扩展到细胞因子检测领域，T cell IFN-; 同年业发展出双色标记技术；1995年，Schielen et.al.: 首次将PVDF膜板引入ELISPOT1997年，Gui et.al.：发展出计算机辅助的斑点技术技术。,用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子（或B细胞分泌的抗体），并以斑点显色的方式将其表现出来。,3.ELISPOT技术原理,1.包被抗体 4 过夜，洗涤；2.封闭37 1h；3.加入淋巴细胞和刺激原37 孵育8-40h；4.冰水裂解并移出细胞，洗涤；5.加入生物素标记的检测抗体37 1h，洗涤；6.加入酶联亲和素37 1h，洗涤；7.加入显色底物，显色1040min；8.获得斑点，计数。,ELISPOT一般操作流程,Elispot实验结果（透明板）,Elispot实验结果（PVDF板）,细胞吞噬功能测定,硝基蓝四氮唑(NBT)试验,吞噬细胞杀菌过程中产生反应性氧中间物，其中超氧阴离子能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中。光镜下计数NBT阳性细胞可反映PMN的杀伤功能。,巨噬细胞吞噬试验,将待测M与鸡红细胞混合温育后，鸡红细胞被M吞噬，根据吞噬百分率确定mf吞噬能力。,吞噬百分率=吞有红细胞的M/M总数,1.反映机体免疫功能状态。2.肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。3.组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施。4.单克隆抗体和细胞因子的生产。,免疫细胞功能检测的临床应用,免疫标记技术,免疫荧光技术 放射免疫分析法 酶免疫技术 发光免疫测定,免疫酶测定法,夹心法ELISA间接ELISABASELISA 利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁,免疫组化技术,定位、定性、定量检测,结肠癌CEA抗原染色,放射免疫测定法(RIA)示意图,形态学检测普通光学显微镜检测荧光显微镜检测 材料：石蜡切片; 冰冻切片; 细胞涂片,细胞凋亡的检测,方法:电镜观察凋亡小体生化学方法免疫学方法末端标记法,形态学方法： PI染液：碘化丙啶(propidium iodide,PI)；核红色 DAPI染液；核蓝色 AO染液（吖啶橙）：核黄绿色* 凋亡细胞呈现核浓缩, 染色加深,凋亡小体。,凋亡的形态学检测,U937 Cell（DAP1染色）,大鼠结肠组织,DNA的断裂,细胞的皱缩,在细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，因而检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(P1)来区分凋亡和坏死细胞。,荧光显微镜观察细胞凋亡,流式检测细胞凋亡,生化学方法电泳法 DNA Ladder电泳图谱,核小体,凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活, 核DNA被切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点(缺口), 暴露出大量3-羟基末端, 如用(TdT)将标记的-dUTP进行缺口末端标记, 则可原位特异地显示出凋亡细胞。 (一)荧光标记法 (二)酶标记法,原位末端转移酶标记技术 (TdT或TUNEL),TUNEL染色原理,U937细胞（荧光素染色）,临床意义-IgG 增高,多克隆性增高 见于各种慢性感染、慢性肝病、淋巴瘤、肺结核、链球菌感染以及自身免疫性疾病 单克隆性增高 仅见一种Ig增高，主要见于免疫增殖性疾病，如IgG分泌型多发性骨髓瘤,见于各种先天性和获得性免疫缺陷病、联合免疫缺陷病、也见于重链病、轻链病、肾病综合症、病毒感染和免疫抑制剂患者,临床意义-IgG 降低,IgA增高 见于IgA型MM（多发性骨髓瘤），SLE,类风湿性关节炎，肝硬化，湿疹和肾脏疾病等 IgA降低 见于反复呼吸道感染，原发和继发性免疫缺陷病和自身免疫性疾病,临床意义-IgA,(1)增高：常见于一些急性时相反应，如急性炎症、传染病早期、排异反应、急性组织损伤。(2)减低：见于系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎活动期、大多数肾小球肾炎(如链球菌感染后肾小球炎、狼疮性肾炎、基底膜增殖性肾小球肾炎)、慢性活动性肝炎、慢性肝病、肝硬化、肝坏死、先天性补体缺乏(如遗传性C3缺乏症)等。它们或是由于消耗或丢失过多或是由于合成能力降低造成。,临床意义补体C3,CD3 + CD4+减低 恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷、艾滋病、免疫抑制