菘蓝叶片离体培养及植株再生-作业.doc

激素对菘蓝叶片组织培养的影响姓名：张亚洲 专业：农学（本硕连读） 班级：10-1 学号：20100099 指导老师：刘帆 倪苏摘要：本研究以菘蓝叶片为外植体，为了研究不同激素及其组合对菘蓝离体叶片的生长的影响，通过对离体消毒的菘蓝叶片采用四种不同激素配比的培养基进行比较培养,发现在相同浓度的6-BA+NAA培养基中NAA在诱导丛生芽中，适宜低浓度的NAA有助于丛生芽的发生且丛生芽诱导效果好，生长健壮，并在适当的范围内随着浓度的升高对丛生芽的生长的抑制作用加强；在相同浓度的2,4-D+KT培养基中，2,4-D对菘蓝叶的愈伤组织的形成有一定的抑制作用，并且对于丛生芽的形成也有较强的抑制作用。但对于其最强的抑制诱导丛生芽和愈伤组织的浓度还有待进一步试验。关键词：菘蓝叶片；激素配比；比较培养；愈伤组织；芽。 菘蓝( Isatis indigotica Fort. )是常用中药板蓝根和大青叶的主要来源植物，具有清热解毒、凉血利咽、解热、抗炎的功效，广泛用于各种方剂1。以往对菘蓝的研究多集中于其根板蓝根化学成分和药理作用(7,8,10）。但由于板蓝根作为一种用量极大且长期销售不衰的药材，市场需求很大。迫切需要生产大量且无病毒植株来满足市场需求，因此人们逐步将植物组织培养这一新技术应用与菘蓝根。有关菘蓝的组织培养前人已经做了一些阶段性研究11,12,如余绍华用菘蓝嫩叶、叶柄和嫩茎为外植体2，陈秋芳、孟玉玲等以叶片作外植体，陈薇等以下胚轴为外植体建立了菘蓝的快速繁殖体系3-5，张胜珍研究了菘蓝叶片原生质体的游离、纯化6，张菊红等9应用正交设计方法,对愈伤组织的诱导和分化培养基进行了优化筛选。本研究，将针对离体消毒的菘蓝叶片采用四种不同激素配比的培养基进行比较培养,观察不同激素配比对菘蓝叶片愈伤组织的形成和芽的分化的影响，对其诱导分化的速度和诱导率进行分析，从而为进一步优化现有对菘蓝的组织培养技术提供重要的参考依据。1 材料与方法1.1 供试材料菘蓝幼叶：由四川农业大学植物生理系提供。1.2 试验方法 1.2.1 材料处理剪取生长正常的菘蓝叶片3-4cm，用纱布包好，置流水下冲洗20-30min。在已灭菌的超净工作台中，用75%的酒精消毒10s，无菌水水漂洗3次；再用0.1%升汞进行消毒10min，每隔1分钟轻轻震荡一次，再用无菌水漂洗4次，消毒完成后用将材料放在已消毒的无菌皿上待用。1.2.2 接种 用消过毒的手术刀切取已处理好的菘蓝叶片0.30.5cm左右的小片，再用镊子，取3片接种到灭菌的诱导培养基MS培养基上（MS培养基/500ml：大量元素/50mL、微量元素/5mL、微量元素/0.5mL、铁盐/5mL、有机物/0.5mL、甘氨酸/1mL、肌醇/50mg），封口。1.2.3 培养观察 先进行一周后的黑暗培养，再将菘蓝叶片转入不同激素组合的离体培养基（表 1）中，放在1500lx-1800lx的光照（14小时/天），252的条件下培养。两周后取生长良好的与菘蓝幼叶的瘀伤组织接种到已灭菌的继代培养基配培养（继代培养基/500ml：蔗糖/15g、琼脂/2.5g、肌醇/50mg、MS/50mL、6-BA/1mg、NAA/0.25mg，pH为5.8），放在1500lx-1800lx的光照（14小时/天），252的条件下培养。观察，并记录数据。表1 不同激素组合培养基（500ml）组别蔗糖/g琼脂/g肌醇/mg不同激素组合培养基2152.550MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1 mg/L3152.550MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.5 mg/L4152.550MS+2,4-D 1.0 mg/L +KT 0.5 mg/L5152.550MS+2,4-D 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L （注：配制好后，调pH为5.8，高压灭菌后备用）1.2.4 数据统计与分析 记录培养不同培养基组合对菘蓝叶片的启动效果（污染数、存活数），以及观察叶片形态变化状况。2 结果与分析通过记录不同培养基中菘蓝叶片的存活率以及死亡原因如表2，发现2号和4号培养基真菌的平均污染率为1.4%相比3号和5号培养基的平均污染率6.51%出现较低；方差分析结果数据无问题，平均真菌感染率为4.0%，但对于造成这种规律的原有待进一步实验证明。通过对细菌污染率进行方差分析发现，5号培养基差异显著，故5号培养基不能作为分析数据，求剩余数据的平均值，得出该试验细菌感染率为3.3%。通过记录培养不同培养基组合对菘蓝叶片的启动效果，得出表2数据。发现培养基中不同种类的激素和激素配比对菘蓝幼叶片的分化效率有一定的影响。通过观察2号培养基菘蓝叶片在添加了NAA和6-BA的MS基本培养基中培养一周左右的时间，发现叶片开始增厚一肿胀一鼓起，21d左右有不定芽原基从叶片边缘产生(图1中2号)，34d不定芽高度可以达到3-4cm(图1中2号)。而观察不同培养基组合的菘蓝叶片离体培养的生长状况（如表2与图1）。通过整体对比可以看出2号和号培养基的激素配比最适合菘蓝诱导丛生芽的离体培养，4号和5号培养基最适合菘蓝诱导愈伤组织的离体培养。通过2号与3号培养基片相比诱导出较多的丛生芽，丛生芽多而繁、高而细，2号只有少数生芽点出现，大多数矮而胖，总的来说2号的比3号长势要好，一方面表明2号（MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1 mg/L）的培养基更有利于诱导出丛生芽，诱导出的丛生芽健壮，个体较大；另一方面表明随着NAA浓度的下降，丛生芽诱导数量及生长状况有下降趋势。通过4号与5号培养基片相比，4号培养基也有丛生芽诱导出，但是都很小，肉眼要仔细观察才能观察到，其主要表现在于出现了较多的愈伤组织；而5号只有叶片卷曲，少数膨胀，有些边缘发黑，愈伤组织很少。从而表明4号培养基诱导出的愈伤组织生长情况比5号培养基的好,而丛生芽生长随2.4-D浓度的升高而加强。图1. 离体培养菘蓝叶片叶片形态序号接种数/个污染数/支污染率/%存活数存活率叶片形态观察真菌细菌真菌细菌2280103.572692.86叶片膨大，卷曲，增厚有20个重生芽出现328217.143.572589.28叶片膨大，卷曲，增厚有10个重生芽点出现435112.82.83394.29叶片卷曲变大有愈伤组织形成534225.885.882985.29叶片卷曲，叶缘变黄或变褐有愈伤组织形成表2.不同培养基组合启动效果观察统计3 结论与讨论 植株组织培养技术是获得无毒植物的重要方法，是植物生物工程技术研究的基础，而植株组织培养是一个复杂的技术体系，与植株本身的激素水平和培养基中的生长调节剂浓度密切相关。在组织培养中，人们常用生长素和细胞分裂素诱导已分化细胞脱分化。2，4-D一般有利于愈伤组织的形成，但对芽的分化有强烈的抑制作用，本试验材料也不例外，在加入2，4一D的培养基上，不能诱导出不定芽，即使再加入6-BA也不行。NAA和2，4一D都是生长素类物质，单纯的NAA或与6-BA组合，都可以诱导不定芽的分化。胡东楠等13，认为随着培养基中6-BA与NAA相对比例的升高，不定芽的分化率会增高。在本试验中，当NAA l.0mg/L，6-BA 0.5mg/L时分化率较高，NAA为0.5 mg/L时的诱导率均低于6-BA为0.1 mg/L时分化率。且丛生芽生长健壮。同时也得出2，4-D在同等的KT的培养基上，低浓度的2，4-D更有利于愈伤组织的生长，因此2，4-D对愈伤组织有一定的生长抑制作用。试验结果表明，菘蓝叶片不易通过愈伤组织发生不定芽，可以不经过愈伤组织阶段直接诱导发生丛生芽，在诱导丛生芽时，不但要考虑诱导污染率的问题，同时也应该考虑诱导分化形态发育程度。在以菘蓝叶片为外植体诱导丛生芽时，得出在相同浓度的6-BA+NAA培养基中NAA在诱导丛生芽中，适宜低浓度的NAA有助于丛生芽的发生且丛生芽诱导效果好，生长健壮，并在适当的范围内随着浓度的升高对丛生芽的生长的抑制作用加强；在相同浓度的2,4-D+KT培养基中，2,4-D对菘蓝叶的愈伤组织的形成有一定的抑制作用，并且对于丛生芽的形成也有较强的抑制作用。但对于其最强的抑制诱导丛生芽和愈伤组织的浓度还有待进一步试验。参考文献：1 张润珍, 张玉文. 板蓝根的研究进展J. 中草药, 2000, 31(6): 474-476.2 余绍华. 菘蓝的组织培养J. 四川师范学院学报, 1991, 12(4): 358-361.3 陈秋芳, 群策, 秦广雍. 菘蓝叶片离体培养与试管无性系的建立J. 河南农业科学, 2007, 38(12):98-100.4 孟玉玲. 菘蓝子叶直接诱导丛生芽J. 中草药, 1995, 20(1): 52.5 陈薇, 杜利云, 寸守铣, 等. 菘蓝下胚轴组织离体培养J. 药学实践杂志, 2000, 18(5): 337-339.6 张胜珍, 客绍英, 马作东, 等. 菘蓝叶肉原生质体游离与纯化研究J. 中药材,2009,5(32): 664-666.7刘云海，秦国伟，丁水平，等板蓝根化学成分的研究()J中草药，2002，33(2)：97998刘海利，吴立军，李华，等板蓝根的化学成分研究J沈阳药科大学学报，2062，19(2)：93968 姚振生药用植物学M北京：中国中医药出版社，2003：2669 张菊红，谢好，汪成刚等. 正交设计在欧洲菘蓝组织培养中的应用J.湖北大学学报(自 然科学版).2006,28(2).10陈民，张晓锋，顾振纶板蓝根药理作用和I临床应用研究进展J中国野生植物资源，2002，21(2)：3611彭菲，王凤翱菘蓝子叶和下胚轴组织培养再生植株的研究J湖南农学院学报，1994，20(5)：450-45612傅翔，张汉明，丁如贤，等激素对菘蓝器官分化的影响J中药材，1997，28(10)：618-62013 SIMES C, ALBARELLO N, CALLADO C H, et al. New approaches for shoot production and establishment of in vitro root cultures of Cleome rosea VahlJ. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2009,98(1): 79-86.14 KIM OT, BANG K H, KIM Y C，et al. Upregulation of ginsenoside and gene expression related to triterpene biosynthesis in ginseng hairy root cultures elicited by methyl jasmonateJ. Plant Cell Tissue Organ Culture,2009, 98(1): 2533.15 SUBOTIC A., JEVREMOVIC S., DRAGOLJUB G. Influence of cytokinins on in vitro morphogenesis in root cultures of Ce