酿酒酵母培养基配方和诱导表达方法.doc

精品文档第一部分 酿酒酵母培养基和培养平板配方所有的液体培养基需用磷酸缓冲液配制：Na2HPO4-7H2O, 10.19g/L, NaH2PO4-H2O 8.56g/L. 称量好所需组分，先把氨基酸、氮源等添加到水中，再添加糖最后添加10X的磷酸缓冲液。液体培养基的PH需在6.25左右。液体选择培养基和丰富培养基可以选择过滤除菌，但是琼脂平板培养基必须高压灭菌丰富非选择培养基2 x (YEPD or) YPD = Yeast Extract Peptone Dextrose20g酵母粉 yeast extract(OXOID LP0021)40 g 蛋白胨peptone (OXOID LP0042)40g葡萄糖 dextrose*（国药 14434-43-7）把除葡糖糖之外的所有组分加入500ml水中溶解，定容至900ml，高压灭菌配置20%的葡萄糖过滤除菌，添加100ml。室温保存1-2个月。*也可以所有组分一起灭菌，但是可能会发生焦化作用，然而焦化作用不会引起任何问题。生长选择合成培养基（Selective Growth Synthetic Media） 2x (SD CAA) 1）用于EBY100菌株配套 pYD 系列载体，或者二配体酵母配套pPNL20 和pPNL30 载体10 g/L 酪蛋白水解物casamino acids (-ade, -ura, -trp)（库存货号：Fluka A2427-250G）40g/L 葡萄糖dextrose（国药 14434-43-7）14g/L YNB Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids （SIGMA Y0626）5.4 g/L Na2HPO4（国药10039-32-4）7.4 g/L NaH2PO4（国药14431-43-7）442）用于YVH10 with pPNL30系列载体10 g/L 酪蛋白水解物（casamino acids (-ade, -ura, -trp) 40g/L 葡萄糖dextrose14g/L YNB （Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids ）40mg/L色氨酸（ tryptophan）5.4 g/L Na2HPO47.4 g/L NaH2PO43)用于JAR with pPNL20系列载体10 g/L 酪蛋白水解物（casamino acids (-ade, -ura, -trp) (BD Bacto #223050)40g/L 葡萄糖dextrose14g/L YNB （Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids ） (BD Difco 233520)20mg/L 尿嘧啶 Uracil5.4 g/L Na2HPO47.4 g/L NaH2PO4Selective scFv (or Fab or ligand) Induction Media抗体scFv (or Fab or 配体)的选择诱导培养基2x (SG-CAA)10 g/L酪蛋白水解物casamino acids (-ade, -ura, -trp) (BD Bacto #223050)2 g/L半乳糖 galactose2 g/L棉子糖 raffinose0.1 g/L葡萄糖 glucose14g/L YNB Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids (BD Difco 233520)5.4 g/L Na2HPO47.4 g/L NaH2PO4 YEPGR or YPGR = Yeast Extract Peptone Galactose/Raffinose10g 酵母粉yeast extract20 g 蛋白胨peptone2%半乳糖 galactose2%葡萄糖 raffinose14g/L YNB Yeast Nitrogen Base with ammonium sulfate w/out amino acids (BD Difco 233520)5.4 g/L Na2HPO47.4 g/L NaH2PO4尿嘧啶和色氨酸母液的配置色氨酸配制成4mg/ml的100X的母液，过滤除菌尿嘧啶配制成2mg/ml的100X的母液，过滤除菌酵母培养基的配置和选择培养基的种类：应用最广泛的酿酒酵母培养基是YPD培养基（酵母粉、蛋白胨、葡萄糖），单克隆在YPD上的生长通常受尿嘧啶、精氨酸和色氨酸的限制。额外的添加这些组分克隆的形成将会加快加大。合成培养基由盐（基本氮源和硫酸胺）碳源（比如葡萄糖）和其他组分（核苷酸和氨基酸）组成。合成培养基可以用drop in” 或者“drop out” 的策略筛选特定原养型菌株“Drop out” 这种培养基是成分确定的营养丰富的培养基，其中添加很多氨基酸和核苷酸来支持菌株的生长。菌株可以在这种培养基中快速生长，接近在YPD平板上的生长速度，“Drop out”培养基通常称为完全合成培养基，简称SC，缺失某一种氨基酸或者核苷酸可以选择特定的原养型。“Drop in”培养基仅包括基本的组分（盐和汤）和菌株生长所需的特定氨基酸和核苷酸。菌株必须用这些需分合成大部分生长所需的前体。“Drop in”培养基通常称为葡萄糖合成培养基，简称SD。简单的组分降低了成本并且容易配置，但是克隆形成时间将会慢两倍。并且SD培养基不易保存（4放置两个月即失效）酵母菌株可以以穿刺菌、液体饱和培养物、平板的形式保存，有些时候甚至可以保存在Whatman滤纸上。收到菌株后最好摇一批新鲜的菌液冻存甘油菌。虽然酵母可以在4平板上放置几个月仍然可以存活，然而存活的菌株多样性却在下降。为了避免部分菌株的富集导致群体性质与原来相比出现偏离，接到菌株后需要马上冻存。在某些时间验证至少两个克隆的选择标记是很有必要的。你会注意到，有一些微小菌落（通常占群体的1 -10%）在丰富培养基上生长缓慢（在非发酵性碳源培养基中不能生长，比如葡萄糖）。这些微小菌落在YPD培养基上呈现典型的牛奶白色，而正常的克隆则呈奶油色。这种现象可以通过保存甘油菌避免酵母菌株可以在含15%甘油的YPD中保存数年，不需在干冰/乙醇上快速冷冻。要确保冷冻前菌液和甘油培养基混合均匀。需用新鲜培养的细胞冻存菌种，可以从固体平板上挑取菌落冻存（挑取火柴头大小的一块）或者取液体培养的菌株（离心取大约5 x 107 个细胞）。可以直接从选择培养基上取菌株用YPD/甘油冻存第二部分 酵母细胞的培养和scFv/Fab/toxin agment/ligand的诱导表达1. 从-80取甘油菌划SD-CAA（转化菌或者二配体酵母）或者YPD（只限野生型菌株），30度培养2d，挑取单克隆。接种2-5ml SD-CAA or YPD（野生型菌株培养，用于转化）250rpm，30，培养过夜。2. 过夜培养菌OD600应该在1-3之间，即使在丰富培养集中也不会超过7，在选择培养基中不会低于1。在倒置显微镜中观察菌株的状态和是否被污染3. 如果没有污染菌株状态良好，用1.5ml eppendorf 离心管13000rpm离心1-2min或者用15 ml fulcon 管3000rpm离心5min4. 对于scFv or Fab的诱导展示，用SG-CAA重悬细胞，调整细胞密度至OD600 = 1-2，18，250rpm，摇24-48h。5. 离心收集细胞，用FACS缓冲液冲洗，用Alexia