星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离、培养与鉴定.pdf

中国组织工程研究 第17卷 第1期 2013 01 01 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 1 2013 Vol 17 No 1 doi 10 3969 j issn 2095 4344 2013 01 009 http www crter org 宋晓斌 杨智勇 邓兴力 王向鹏 张胜平 黄金 张兴逵 星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离 培养与鉴定 J 中国组织工程研究 2013 17 1 56 61 P O Box 1200 Shenyang 110004 www CRTER org 56 www CRTER org 宋晓斌 男 1965 年生 云南省会泽县人 汉族 1999 年华中科技大学同 济医学院毕业 博士 主 任医师 硕士生导师 主 要从事胶质瘤的基础与临 床研究 Sxb8 通讯作者 杨智勇 博士 主任医师 教授 博士生 导师 昆明医科大学第一 附属医院神经外科 云南 省昆明市 650032 中图分类号 R394 2 文献标识码 A 文章编号 2095 4344 2013 01 00056 06 收稿日期 2012 09 03 修回日期 2012 10 25 20111203016 W S 星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离 培养与鉴定 宋晓斌 杨智勇 邓兴力 王向鹏 张胜平 黄 金 张兴逵 昆明医科大学第一附属医院神经外科 云南省昆明市 650032 文章亮点 1 文章在设想人星形胶质细胞瘤中存在有肿瘤干细胞的基础上 探讨人星形胶质瘤脑肿瘤干细胞分离 培养及鉴定的方法 2 实验建立了人星形细胞瘤干细胞分离培养与鉴定的方法 3 通过 CD133 和巢蛋白免疫鉴定 诱导分化的方法从人星形胶质细胞瘤标本中分离 培养及鉴定了 星形胶质瘤干细胞 4 实验发现在无血清培养基中 人星形胶质细胞瘤能够呈类似神经干细胞球样细胞球 悬浮生长并且 随着实验的延长 神经球逐渐增大 增多 神经球样的细胞均表达 CD133 和巢蛋白 经诱导能分化为 神经元及胶质细胞表型的细胞 5 实验结果提示 星形胶质细胞瘤中存在具有神经干细胞特性的肿瘤干细胞 6 目前对 CD133 作为胶质瘤干细胞的特异性标记物现在存在有争论 提示胶质瘤干细胞表型的复杂 可能存在有多种胶质瘤干细胞表型 运用单一的抗原标记来识别胶质瘤干细胞是不合适的 关键词 干细胞 肿瘤干细胞 星形胶质瘤 脑 CD133 巢蛋白 神经元特异性烯醇化酶 胶质纤维酸性蛋 白 细胞培养 免疫细胞化学 省级基金 干细胞图片文章 摘要 背景 肿瘤干细胞理论认为肿瘤中存在一小部分具有无限增殖潜能和自我更新能力 能够分化为成熟 细胞表型的干细胞样细胞 对肿瘤发生 增殖 侵袭起关键作用 目的 建立体外分离 培养与鉴定星形胶质细胞瘤干细胞的方法 方法 采用直接培养法分离培养星形胶质细胞瘤干细胞 参照神经干细胞培养条件 进行体外培养 观察其增殖 分化并进行巢蛋白 CD133 免疫细胞化学鉴定和诱导分化后神经元特异性烯醇化酶 胶 质纤维酸性蛋白及 O4 免疫细胞化学鉴定 结果与结论 培养 7 10 d 可形成大量悬浮生长巢蛋白及 CD133 免疫阳性的神经球 经诱导分化后 细胞呈神经元特异性烯醇化酶 胶质纤维酸性蛋白或 O4 免疫阳性 提示星形胶质细胞瘤中存在具有 神经干细胞特性的肿瘤干细胞 CD133 和巢蛋白是星形胶质细胞瘤干细胞重要的表面标记 可以用于 星形胶质细胞瘤干细胞的分离 In vitro isolation culture and identification of brain tumor stem cells from human astrogliomas Song Xiao bin Yang Zhi yong Deng Xing li Wang Xiang peng Zhang Sheng ping Huang Jin Zhang Xing kui Department of Neurosurgery First Affiliated Hospital of Kunming Medical College Kunming 650032 Yunnan Province China 宋晓斌 等 星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离 培养与鉴定 ISSN 2095 4344 CN 21 1581 R CODEN ZLKHAH 57 www CRTER org Song Xiao bin M D Chief physician Master s supervisor Department of Neurosurgery First Affiliated Hospital of Kunming Medical University Kunming 650032 Yunnan Province China sxb8 Corresponding author Yang Zhi yong M D Chief physician Professor Doctoral supervisor Department of Neurosurgery First Affiliated Hospital of Kunming Medical University Kunming 650032 Yunnan Province China Supported by the Natural Science Foundation of Yunnan Province No 2007C244M Applied Basic Research Program of Yunnan Province No 2009CD162 Received 2012 09 03 Accepted 2012 10 25 Abstract BACKGROUND According to the theory of tumor stem cells there are a small amount of stem cell like cells that exhibit infinite proliferative potential and self renewal capacity can differentiate into cells with the phenotype of mature cells and play a key role in tumor production proliferation and invasion OBJECTIVE To investigate the feasibility of isolation culture and identification of brain tumor stem cells from human astrogliomas METHODS Brain tumor stem cells were isolated by primary culture from human astrogliomas These cells were cultured under the culture condition of neural stem cells The clone spheres were identified with immunocytochemistery for nestin and CD133 At the same time differentiated cells were identified by immunocytochemistery for neuron specific enolase glial fibrillary acidic protein and O4 respectively RESULTS AND CONCLUSION After 7 10 days of culture a great number of neurospheres immunoreactive for nestin and CD133 were observed After induced differentiation these cells were immunoreactive for neuron specific enolase glial fibrillary acidic protein and O4 These findings suggest that there are brain tumor stem cells with the characteristics of neural stem cells in human astrogliomas CD133 and nestin are key surface markers for brain tumor stem cells which can be used for isolation of brain tumor stem cells Key Words stem cells tumor stem cells astroglioma brain CD133 nestin neuron specific enolase glial fibrillary acidic protein cell culture immunocytochemistry provincial grants supported paper stem cell photographs containing paper Song XB Yang ZY Deng XL Wang XP Zhang SP Huang J Zhang XK In vitro isolation culture and identification of brain tumor stem cells from human astrogliomas Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu 2013 17 1 56 61 0 引言 星形胶质细胞瘤是最常见的神经上皮肿瘤 占颅内肿瘤的13 26 占胶质瘤 21 2 51 6 1 长期以来治疗效果均欠佳 20世纪末在血液病研究中首先发现的肿瘤干细 胞 2 随后在胰腺癌 乳腺癌 前列腺癌等的研究中也发现了肿瘤干细胞 3 5 提出了肿瘤干 细胞理论 肿瘤干细胞理论认为肿瘤中存在一小部分具有无限增殖潜能和自我更新能力 能 够分化为成熟细胞表型的干细胞样细胞 对肿瘤的发生 增殖 侵袭起关键作用 根据该理 论 神经科学家从不同种类的脑肿瘤中分离出肿瘤干细胞 6 8 设想人星形胶质细胞瘤中存 在有肿瘤干细胞 实验将探讨人星形胶质瘤脑肿瘤干细胞分离 培养及鉴定的方法 为进一 步开展以肿瘤干细胞为靶点的肿瘤治疗奠定基础 1 材料和方法 设计 单一样本观察 时间及地点 实验于2009年4月至9月在自昆明医学院第一附属医院完成 材料 星形胶质细胞瘤干细胞的分离 培养与鉴定实验所用主要试剂 Main experimental reagents and instruments 试剂 来源 DMEM F12 培养基 B 27 添加剂 N 2 添加剂 表皮生长因子 碱性成纤维细胞生长因子 小鼠抗人 CD 133 单克隆抗体 兔抗人巢蛋白多克隆抗体 兔抗人神经元特异性烯醇化酶多克隆抗体 兔抗人胶质纤维酸性蛋白多克隆抗体 小鼠抗人 O4 单克隆抗体 Cy3 标记山羊抗小鼠 IgG ALEXA 488 标记的山羊抗兔 IgG DAPI Gibco Invitrogen Miltenyi Biotec Abcam Santa Cruz Chemicon Jackson Immunoresearch Sigma 宋晓斌 等 星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离 培养与鉴定 P O Box 1200 Shenyang 110004 www CRTER org 58 www CRTER org 组织标本 星形胶质瘤标本取自昆明医学院第一附属 医院2008年3月至2009年3月神经外科新鲜手术切除标 本 全部经病理检查确诊 诊断标准按WHO分类进行 病理分级按Kernohan法 实验方法 肿瘤干细胞的分离培养 无菌条件下 将组织标本剪 成1 mm 1 mm 1 mm的碎块 D Hank s液漂洗后 火 焰抛光的吸管吹打 200目筛网过滤制备单细胞悬液 红细胞裂解液去除红细胞 调整细胞浓度至1 109 L 1 神 经干细胞完全培养液 DMEM F12 1 N2 20 g L表皮 生长因子 20 g L碱性成纤维细胞生长因子 37 体积分数5 CO2培养 原代接种后 每天观察细胞的生 长情况 三四天半量换液 5 7 d即可传代 传代时 离心收集克隆球 机械吹打使其分散成单个细胞 以 1 108 L 1的细胞浓度传代 37 体积分数5 CO 2继 续培养 克隆形成实验 取原代克隆球 机械分离制备单细胞 悬液 调整细胞浓度至4 104 L 1 50 L 孔接种96孔培 养板中 37 体积分数5 CO2培养 2 h后在倒置显 微镜下观察并记录只有1个细胞的培养孔 每天动态观 察标记孔中单细胞的分裂及克隆形成情况 当克隆球增 大至200个细胞 球时 即可传代 肿瘤干细胞的鉴定 离心收集克隆球 以神经干细胞 分化培养液 DMEM F12 体积分数1 胎牛血清 1 N2 重悬 接种于预先放置多聚赖氨酸包被盖玻片的培养板 中 37 体积分数5 CO2培养1 h 进行巢蛋白 CD133免疫细胞化学及免疫荧光染色鉴定 体外诱导分化 离心收集克隆球 以神经干细胞分化 培养液重悬 接种于预先放置多聚赖氨酸包被盖玻片的 培养板中 37 体积分数5 CO2培养箱培养7 d 每 天观察细胞的分化情况 7 d后分别进行神经元特异性 烯醇化酶 胶质纤维酸性蛋白和O4免疫细胞化学及免疫 荧光染色鉴定细胞的分化情况 主要观察指标 原代及传代培养的肿瘤干细胞生 长情况 克隆形成实验结果 肿瘤干细胞的鉴定结 果 体外诱导分化结果 2 结果 2 1 原代及传代培养的肿瘤干细胞生长情况 原代细 胞接种12 h多数细胞沉底 部分细胞贴壁 48 h可见细 胞分裂相 72 h部分贴壁细胞分化 凋亡 而部分细胞 形成细胞集落 悬浮生长 随着时间推移 细胞集落不 断增大形成克隆球 7 10 d可观察到直径几百个细胞大 小的克隆球 见图1 2 2 克隆形成实验结果 单细胞接种24 h即可见细胞 分裂相 72 h可观察到由数十个细胞组成的细胞集落 5 7 d形成克隆球 见图2 图 1 人星形胶质瘤肿瘤干细胞的分离培养 100 Figure 1 Isolation and culture of brain tumor stem cells from human astrogliomas 100 A 原代肿瘤干细胞接种 24 h 大部 分细胞贴壁 B 肿瘤干细胞培养 48 h 可见细胞 分裂相 C 肿瘤干细胞培养 72 h 部分细胞 形成细胞集落 悬浮生长 D 肿瘤干细胞培养 7 10 d 可观察 到直径几百个细胞大小的克隆球 图 2 人星形胶质瘤肿瘤干细胞的单克隆培养 200 Figure 2 Monoclonal culture of brain tumor stem cells from human astrogliomas 200 A 肿瘤干细胞单细胞 B 肿瘤干细胞接种 24 h 即可见细 胞分裂相 C 肿瘤干细胞培养 72 h 可观察到 由数十个细胞组成的细胞集落 D 肿瘤干细胞培养 5 7 d 形成克 隆球 宋晓斌 等 星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离 培养与鉴定 ISSN 2095 4344 CN 21 1581 R CODEN ZLKHAH 59 www CRTER org 2 3 肿瘤干细胞的鉴定结果 第3代克隆球于神经干 细胞分化培养基中培养1 h后贴壁 免疫细胞化学染色 结果显示细胞呈巢蛋白 CD133免疫阳性反应 见图3 2 4 体外诱导分化结果 见图4 图 4 人星形胶质瘤肿瘤干细胞的体外诱导分化 Figure 4 In vitro induced differentiation of brain tumor stem cells from human astrogliomas 200 A 肿瘤干细胞诱导分化 24 h 可见部分细胞从克隆球迁出 长出突起 200 B 肿瘤干细胞诱导分化 5 d 后细胞的突起形态更加典型 相邻细胞的突起互 相连接 100 C D 肿瘤干细胞诱导分化 7 d 后 克隆球中的细胞几乎全部贴壁分化 相邻细胞球之间的细胞突起互相连接成网 分化细胞具有多种形 态 异质性明显 100 E L 肿瘤干细胞诱导分化 7 d 后呈神经元特异性烯醇化酶免疫反应阳性 免疫细胞化学染色 200 F DAPI 复染核 200 G 神经元特异性烯醇化酶 DAPI 共聚焦图片 200 H 肿瘤干细胞诱导分化 7 d 后呈胶质纤维酸性蛋白免疫反应阳性 免疫细胞化学染色 200 I DAPI 复染核 200 J 胶质纤维酸性蛋白 DAPI 共聚焦图片 200 K 肿瘤干细胞诱导分化 7 d 后呈 O4 免疫反应阳性 免疫细胞化学染色 200 M DAPI 复染核 200 N O4 神经元特异性烯醇化酶 DAPI 共聚焦图片 200 图 3 人星形胶质瘤肿瘤干细胞的鉴定 免疫细胞化学染色 200 Figure 3 Identification of brain tumor stem cells from human astrogliomas immunohistochemical staining 200 A 肿瘤干细胞呈巢蛋白免疫阳性反应 B 肿瘤干细胞 DAPI 复染核 C 巢蛋白 DAPI 共聚焦图片 D 肿瘤干细胞呈 CD133 免疫阳 性反应免疫阳性反应 E 肿瘤干细胞 DAPI 复染核 F CD133 DAPI 共聚焦图片 宋晓斌 等 星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离 培养与鉴定 P O Box 1200 Shenyang 110004 www CRTER org 60 www CRTER org 第3代克隆球于神经干细胞分化培养基中培养1 h后 贴壁 24 h可见部分细胞从克隆球迁出 长出突起 72 h 可观察到大量分化细胞在细胞球周围呈放射状排列 5 d 后 分化细胞的突起形态更加典型 相邻细胞的突起互相 连接 7 d后 克隆球中的细胞几乎全部贴壁分化 相邻 细胞球之间的细胞突起互相连接成网 分化细胞具有多种 形态 异质性明显 7 d后免疫细胞化学染色结果显示分 化细胞呈神经元特异性烯醇化酶 胶质纤维酸性蛋白或 O4免疫反应阳性 3 讨论 实验采用无血清培养法并通过CD133和巢蛋白免 疫鉴定 诱导分化的方法从人星形胶质细胞瘤标本中分 离 培养及鉴定了星形胶质瘤干细胞 3 1 星形胶质瘤中存在胶质瘤干细胞 实验发现在无 血清培养基中 人星形胶质细胞瘤能够呈类似神经干细 胞球样细胞球 悬浮生长并且随着实验的延长 神经球 逐渐增大 增多 神经球样的细胞均表达CD133和巢蛋 白 经诱导能分化为神经元及胶质细胞表型的细胞 目 前公认的肿瘤干细胞应具备下列特征 在神经干细胞 培养条件下 可形成典型的神经球 表达神经干细胞 特异性分子标志 具有自我更新和无限增殖能力 可经诱导分化为多个细胞表型 多名学者根据该标准从 脑肿瘤标本及细胞株中分离 培养 鉴定出脑肿瘤干细 胞 7 9 10 根据该鉴定标准 作者认为人星形胶质细胞 瘤中存在具有肿瘤干细胞并且可通过无血清培养法培 养 通过CD133和巢蛋白及细胞具有多向分化能力来进 行免疫及功能鉴定 3 2 星形胶质瘤干细胞的特异性标记物 实验中采用 CD133及巢蛋白作为特异性抗原来鉴定胶质瘤干细胞 以此二抗原鉴定的胶质瘤干细胞具有成神经球样生长 并且具有多向分化能力 CD133糖蛋白是细胞表面蛋白 超家族的一员 相对分子质量为117 000 由865个氨基 酸组成 其结构包含一个细胞外区的N 端 两个大的细 胞外loop环 一个由59个氨基酸组成的细胞内尾 5个 跨膜区域 8个N 糖基化区 CD133糖蛋白是一个单拷 贝基因产物 基因位于4p15 含有37个外显子 在多种 干细胞和前体细胞中都有特异性的表达 巢蛋白属于中 间丝家族的第 类 11 它反映了神经上皮细胞的分化 增殖的状态 巢蛋白能在神经上皮的前体细胞中特异性 表达 并在细胞分化过程中从优势表达到逐渐减少并最 终消失 因此它被认为是多向潜能神经前体细胞的标 记 对CD133作为胶质瘤干细胞的特异性标记物现在 存在有争论 支持CD133作为胶质瘤干细胞特异性标记 物的研究如下 许多学者从新鲜标本和各种胶质瘤细 胞系中分离的CD133阳性细胞具有自我更新 无限繁殖 和动物致瘤能力 12 具有干细胞特性 CD133阳性与 放化疗抵抗有关 Liu等 13 检验了CD133 细胞中基因的 表达 发现在CD133阳性细胞中CD90 CD44 CXCR4 巢蛋白 Msi1和MELK增加15 6 5 7 337 8 21 4 84和1 351倍 CD133 细胞高表达BCRP1和MGMT1基 因和抑制凋亡的基因 这些基因的高表达与肿瘤的化疗 抵抗性有关 Qiang等 14 对U251 U87MG A172胶质 瘤细胞系的研究中发现CD133阳性细胞对缺氧 电离辐 射和化疗比CD133阴性细胞的要更有抵抗性 Thon 等 15 分析了CD133 细胞和胶质瘤病理级别的关系 发 现许多CD133阳性细胞成簇分布在肿瘤血管周边 肿瘤 组织块中CD133阳性细胞的数量与肿瘤级别有明确的 数量上的关系 Beier等 16 研究了CD133和高级别少 突胶质细胞瘤预后的关系 发现CD133的表达预示着高 级别少突胶质瘤患者较差的预后 实验结果支持CD133 是星形胶质瘤干细胞的特异性标记物 不支持CD133作为胶质瘤干细胞特异性标记物的 支持点如下 Griguer等 17 研究了在人类胶质瘤细胞中 CD133表达是否被影响线粒体功能的生物事件所调节 发现 缺氧导致CD133可逆性的上调 药物抑制电 子传递链的抑制造成的线粒体功能障碍上调CD133水 平 该作用与线粒体膜电位的改变有负相关 稳定的 缺失线粒体DNA的胶质瘤细胞的产物增加了CD133的 表达 许多学者的研究发现约40 新鲜恶性胶质瘤标本 以及大多数胶质瘤细胞系中检测不到CD133的表达 18 CD133阴性细胞同样具有自我更新 肿瘤形成能力 甚 至有更大的侵袭性 19 以上的研究提示胶质瘤干细胞表型的复杂 可能存 在有多种胶质瘤干细胞表型 运用单一的抗原标记来识 别胶质瘤干细胞是不合适的 而且不同的胶质瘤由不同 的胶质瘤干细胞形成 同一胶质瘤组织内也拥有不同的 胶质瘤干细胞 18 20 21 这些胶质瘤细胞的基因表达 生 长特性 致瘤能力等不尽相同 宋晓斌 等 星形胶质细胞瘤干细胞的体外分离 培养与鉴定 ISSN 2095 4344 CN 21 1581 R CODEN ZLKHAH 61 www CRTER org 肿瘤干细胞理论的提出为肿瘤的治疗指出了新的 方向 实验建立了人星形细胞瘤干细胞分离培养与鉴定 的方法 为进一步研究胶质瘤干细胞的特性及针对胶质 瘤干细胞的治疗奠定了基础 基金资助 云南省自然科学基金 2007C244M 云南省 应用基础研究项目 2009CD162 作者贡献 设计 实施 评估均为本文作者 均受过系统 培训 利益冲突 课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组 织直接或间接的经济或利益的赞助 伦理要求 参与实验的患病个体及其家属自愿参加 对实 验过程完全知情同意 作者声明 文章为原创作品 数据准确 内容不涉及泄密 无一稿两投 无抄袭 无内容剽窃 无作者署名争议 无与他 人课题以及专利技术的争执 内容真实 文责自负 4 参考文献 1 Gotlieb Stematsky T Yaniv A Gazith A Spontaneous malignant transformation of hamster embryo cells in vitro J Natl Cancer Inst 1966 36 3 477 482 2 Bonnet D Dick JE Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell Nat Med 1997 3 7 730 737 3 Al Hajj M Wicha MS Benito Hernandez A et al Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells Proc Natl Acad Sci U S A 2003 100 7 3983 3988 4 Li C Heidt DG Dalerba P et al Identification of pancreatic cancer stem cells Cancer Res 2007 67 3 1030 1037 5 Collins AT Berry PA Hyde C et al Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells Cancer Res 2005 65 23 10946 10951 6 Huang Q Dong J Zhu YD et al Isolation and culture of tumor stem cells from human brain glioma tissues Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 2006 28 5 331 333 7 Yu SC Yi L Zhou ZH et al Isolation and identification of tumor stem like cells 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