考研生物化学笔记.doc

生物化学一、生物化学的概念 生物化学是研究生命现象化学本质的学科。生物化学就是生命的化学。 生物化学是研究生物体内的化学分子构成，分子结构、性质、功能及其在体内代谢过程的学科。代谢包括物质和能量两方面。生物化学是研究生物的化学组成和化学变化的，所以生物化学也可以分作两大部分内容： 化学组成部 分，也称为静态生物化学，主要探讨构成生物体的分子类型、分子结构、化学性质及生物功能； 化学 变化部分，讨论的是生物体内的化学分子之间如何进行转化，即研究生物体内的化学反应，以及这些反 应发生的部位和反应机理，以及伴随这些反应所产生的能量变化。 简单讲生物化学就研究生物体的化学组成和生命中的化学变化。二、生物化学的发展史 生物化学的研究始于18世纪下半叶，但作为一门独立的学科是在20世纪初。 1629年荷兰人海尔蒙特进行了柳枝试验，100磅土，2磅重柳枝，只浇水，5年后土和柳枝共重169磅，土减少了二两，论文发表于1648年（死后2年）。 1775年拉瓦锡进行定量试验，证明呼吸过程和化学氧化是相同的。并推测呼吸形成的CO2也是由于吸入了 氧气，与体内的有机物结合并氧化为CO2，从而将呼吸氧化与燃烧联系在一起。 1783年拉瓦锡和拉普拉斯在法国科学院院报发表论文，提出动物热理论呼吸相当于不发光的燃烧。 并测定了释放CO2和释热的关系。现在一般把这一年称为生化开始年。并把拉瓦锡称为生物化学之父。 但在这同一时期的开拓者还有普利斯特列和舍勒（Scheele），前者发现了光合现象；后者在1770年发现 了洒石酸，之后又从膀胱结石中分离出尿酸，并对苹果酸、柠檬酸，甘油等进行了大量研究。舍勒是瑞 典人，学徒工出身，非常热爱化学，最后成为化学家。 进入十九世纪，科学发展大大加快，成就不断涌现，例如 1828年维勒（李比西的学生）人工合成了第一个有机物尿素，证明有机物可以人造。 1838年施来登与施旺发表细胞学说。（在1839年）细胞是有机体，整个动物和植物乃是细胞的集合体。 它们按照一定的规律排列在动植物体内。这一学说把植物和动物统一起来。 *1842年李比西（德国人）在有机化学在生理学与病理学上的应用一书中首次提出新陈代谢一词。 *1860年巴斯德又对洒精发酵进行了研究首次提出发酵是由酵母菌或细菌引起的，此研究为后来的糖代谢和呼吸作用研究奠定了基础。 1871年米切尔（Miescher霍佩的学生-瑞典人）发表文章分离出核素，即DNA。当时年仅24岁，是首次从 脓细胞中分离出脱氧核糖核蛋白。实际分离在1868年完成，论文在1871年发表。 1877年德国生理学家医生霍佩赛勒，首次提出生物化学一词Biochemie，英文为Biochemistry。并 且首次提出蛋白质一词。 1897年Buchner用酵母无细胞提取液发酵成功，证明酶的存在。许多人开始提取酶，但都未成功。 二十世纪初，在维生素、激素、酶的研究方面发展较快。 1902年艾贝尔（Abel美国人）在德国学习七年，1903年制成肾上腺素晶体；后来又在1926年制成胰岛素 晶体。 1905年Knoop提出了脂肪酸的b-氧化作用。同年Starling提出激素（Hormere）一词。 1907年霍克（池延登的学生，美国人）发表实验生理化学一书，实际上就是生物化学的前身。这就 标志着生物化学已经形成，已经从生理学中独立出来。 1911年波兰科学家Funk结晶出抗神经炎维生素，并命名为Vitamine，意为生命的胺，实际是复合维生素B。 1913年米利切斯和曼顿研究了酶的动力学提出了米曼方程。同年Wilstatter和Stoll分离出了叶绿素。 1930年Northrop分离出胃蛋白酶，并证明是蛋白质。 1933年Krebs和Henselen发现尿素循环；同年Embdem和Meyerhof初步完成了糖酵解途径的中间产物研究。 提出了糖酵解途径。 1937年Krebs提出了三羧酸循环的假说；同年Lohmann和Selitser证明硫胺素是丙酮酸羧化酶辅基的组成 成分；在此期间Kalcker及Belitser各自对氧化磷酸化作用进行了定量研究。 1944年Avery，Maeleod和McCarty完成了肺炎球菌转化试验，证明DNA是遗传物质。 1948年Calvin和Bessen发现磷酸甘油酸是光合作用中CO2固定的最初产物，并用了十年时间完成了卡尔文 循环的整个代谢途径研究。同年Leloir等人发现了尿苷酸在碳水化合物代谢中的作用。 1953年Watson和Criek利用X射线衍射分析了DNA结构，提出了DNA结构的双螺旋结构模型。这一发现为 生物的遗传研究奠定了分子基础。通常把这一年确定为分子生物学的诞生年。同年（1953年），Sanger 和Trhompson完成了胰岛素A链及B链的氨基酸序列测定，二年后报道了胰岛素中二硫键位置。 1956年A.Kornberg发现了DNA聚合酶。与此同年Ubarger发现了从苏氨酸合成异亮氨酸时终产物异亮氨酸 能抑制合成链中的第一个酶，即发现了生物合成过程 的反馈作用。 1958年S.B.Weiss和Hurwitz等人发现了DNA指导的RNA聚合酶；同在此年Crik提出分子遗传的中心法则； Meselson和Stahl用同位素标记方法证明了DNA的半保留复制假说。 1961年Jacob和Monod提出了操纵子学说，并指出了mRNA的功能；同年Weiss和Hurwitz从大肠杆菌中发现 了DNA指导的RNA聚合酶；同年M.Nirenberg和H.Matthei发现了遗传密码（苯丙氨酸的）。为三连体核苷酸。1965中国首次人工全合成了牛胰岛素。 从七十年代后，生物化学的发展主要集中在分子生物学方面。关于中国的生物化学发展，也做一简略回 顾。第一章 蛋白质化学（一）.掌握蛋白质的概念与生物学意义蛋白质是由L-氨基酸通过肽键缩合而成的，具有较稳定的构象和一定生物功能的生物大分子（biomacromolecule）。蛋白质是生命活动所依赖的物质基础，是生物体中含量最丰富的大分子。生物学意义单细胞的大肠杆菌含有3000多种蛋白质，而人体有10万种以上结构和功能各异的蛋白质，人体干重的45%是蛋白质。生命是物质运动的高级形式，是通过蛋白质的多种功能来实现的。新陈代谢的所有的化学反应几乎都是在酶的催化下进行的，已发现的酶绝大多数是蛋白质。生命活动所需要的许多小分子物质和离子，它们的运输由蛋白质来完成。生物的运动、生物体的防御体系离不开蛋白质。蛋白质在遗传信息的控制、细胞膜的通透性，以及高等动物的记忆、识别机构等方面都起着重要的作用。随着蛋白质工程和蛋白质组学的兴起和发展，人们对蛋白质的结构与功能的认识越来越深刻。（二）氨基酸基本结构与性质各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。因此，可以用定氮法来推算样品中蛋白质的大致含量。 每克样品含氮克数6.25100=100g样品中蛋白质含量（g%）组成蛋白质的20种氨基酸有共同的结构特点：1氨基连接在- C上，属于-氨基酸（脯氨酸为-亚氨基酸）。2R是側链，除甘氨酸外都含手性C，有D-型和L-型两种立体异构体。天然蛋白质中的氨基酸都是L-型。 注意：构型是指分子中各原子的特定空间排布，其变化要求共价键的断裂和重新形成。旋光性是异构体的光学活性，是使偏振光平面向左或向右旋转的性质，（-）表示左旋，（+）表示右旋。构型与旋光性没有直接对应关系。1一般物理性质-氨基酸为无色晶体，熔点一般在200 oC以上。各种氨基酸在水中的溶解度差别很大（酪氨酸不溶于水）。一般溶解于稀酸或稀碱，但不能溶解于有机溶剂，通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。芳香族氨基酸（Tyr、Trp、Phe）有共轭双键，在近紫外区有光吸收能力，Tyr、Trp的吸收峰在280nm，Phe在265 nm。由于大多数蛋白质含Tyr、Trp残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值，是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。2两性解离和等电点（isoelectric point, pI） 氨基酸在水溶液或晶体状态时以两性离子的形式存在，既可作为酸（质子供体），又可作为碱（质子受体）起作用，是两性电解质，其解离度与溶液的pH有关。 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势和程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点。氨基酸的pI是由-羧基和-氨基的解离常数的负对数pK1和pK2决定的。计算公式为：pI=1/2(pK1+ pK2)。若1个氨基酸有3个可解离基团，写出它们电离式后取兼性离子两边的pK值的平均值，即为此氨基酸的等电点（酸性氨基酸的等电点取两羧基的pK值的平均值，碱性氨基酸的等电点取两氨基的pK值的平均值）。3氨基酸的化学反应 氨基酸的化学反应是其基团的特征性反应。重要的有：（1）茚三酮反应 所有具有自由-氨基的氨基酸与过量茚三酮共热形成蓝紫色化合物（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质）。用分光光度法可定量测定微量的氨基酸。蓝紫色化合物的最大吸收峰在570nm波长处，黄色在440nm波长下测定。吸收峰值的大小与氨基酸释放的氨量成正比。 （2）与2，4-二硝基氟苯（DNFB）的反应（sanger 反应） 在弱碱性溶液中，氨基酸的-氨基很容易与DNFB作用生成稳定的黄色2，4-二硝基苯氨基酸（DNP-氨基酸），这一反应在蛋白质化学的研究史上起过重要作用，Sanger等人应用它测定胰岛素一级结构。（3）Edman反应多肽顺序自动分析仪是根据相类似的原理设计的，即利用多肽链N端氨基酸的-氨基与异硫氰酸苯酯PITC反应（Edman降解法）。氨基酸的分类）根据R基团对20种蛋白质氨基酸的分类及其三字符的缩写1按R基的化学结构分为脂肪族、芳香族、杂环、杂环亚氨基酸四类。2按R基的极性和在中性溶液的解离状态分为非极性氨基酸、极性不带电荷、极性带负电荷或带正电荷的四类。 带有非极性R（烃基、甲硫基、吲哚环等，共9种）：甘（Gly）、丙（Ala）、缬（Val）、亮（Leu）、异亮（Ile）、苯丙（Phe）、甲硫（Met）、脯（Pro）、色（Trp） 带有不可解离的极性R（羟基、巯基、酰胺基等，共6种）：丝（Ser）、苏（Thr）、天胺（Asn）、谷胺（Gln）、酪（Tyr）、半（Cys）带有可解离的极性R基（共5种）：天（Asp）、谷（Glu）、赖（Lys）、精（Arg）、组（His），前两个为酸性氨基酸，后三个是碱性氨基酸。蛋白质分子中的胱氨酸是两个半胱氨酸脱氢后以二硫键结合而成，胶原蛋白中的羟脯氨酸、羟赖氨酸，凝血酶原中的羧基谷氨酸是蛋白质加工修饰而成。（三）蛋白质的结构与功能1.肽（peptide）概念：由氨基酸通过肽键相连而成的化合物称为肽。2.肽的理化性质（与氨基酸相似）蛋白质的分子结构一、 蛋白质的一级结构（primary structure）（蛋白质的共价结构有时也称蛋白质的一级结构或称化学结构） 蛋白质的一级结构只指肽链中的氨基酸序列。蛋白质的一级结构是由共价键形成的，如肽键和二硫键。而维持空间构象稳定的是非共价的次级键。如氢键、盐键、疏水键、范德华引力等。1953年，英国科学家F. Sanger首先测定了胰岛素（insulin）的一级结构，有51个氨基酸残基，由一条A链和一条B链组成，分子中共有3个二硫键，其中两个在A、B链之间，另一个在A链内。蛋白质的一级结构测定或称序列分析常用的方法是Edman降解和重组DNA法。Edman降解是经典的化学方法，比较复杂。首先要纯化一定量的待测蛋白质，分别作分子量测定、氨基酸组成分析、N-末端分析、C-末端分析；要应用不同的化学试剂或特异的蛋白内切酶水解将蛋白质裂解成大小不同的肽段，测出它们的序列，对照不同水解制成的两套肽段，找出重叠片段，最后推断蛋白质的完整序列。重组DNA法是基于分子克隆的分子生物学方法，比较简单而高效，不必先纯化该种蛋白质，而是先要得到编码该种蛋白质的基因（DNA片段），测定DNA中核苷酸的序列，再按三个核苷酸编码一个氨基酸的原则推测蛋白质的完整序列。这两种方法可以相互印证和补充。目前，国际互联网蛋白质数据库已有3千多种一级结构清楚。蛋白质一级结构是空间结构和特异生物学功能的基础。二、蛋白质的二级结构（secondary structure）蛋白质的二级结构是指其分子中主链原子的局部空间排列，是主链构象（不包括侧链R基团）。构象是分子中原子的空间排列，但这些原子的排列取决于它们绕键的旋转，构象不同于构型，一个蛋白质的构象在不破坏共价键情况下是可以改变的。但是蛋白质中任一氨基酸残基的实际构象自由度是非常有限的，在生理条件下，每种蛋白质似乎是呈现出称为天然构象的单一稳定形状。20世纪30年代末，L.Panling 和R.B.Corey应用X射线衍射分析测定了一些氨基酸和寡肽的晶体结构，获得了一组标准键长和键角，提出了肽单元（peptide unit）的概念, 还提出了两种主链原子的局部空间排列的分子模型（-螺旋）和（-折叠）。1肽单位 肽键及其两端的-C共6个原子处于同一平面上，组成了肽单位（所在的平面称肽键平面）。肽键CN键长为0.132nm，比相邻的单键（0.147nm）短，而较C=N双键（0.128nm）长，有部分双键的性质，不能自由旋转。肽键平面上各原子呈顺反异构关系，肽键平面上的O、H以及2个-碳原子为反式构型（trans configuration）。主链中的CC和CN单键可以旋转，其旋转角、决定了两个相邻的肽键平面相对关系。由于肽键平面的相对旋转，使主链可以以非常多的构象出现。事实上，肽链在构象上受到很大限制，因为主链上有1/3不能自由旋转的肽键，另外主链上有很多侧链R的影响。蛋白质的主链骨架由许多肽键平面连接而成。2.-螺旋(-helix) -螺旋是肽键平面通过-碳原子的相对旋转形成的一种紧密螺旋盘绕，是有周期的一种主链构象。其特点是： 螺旋每转一圈上升3.6个氨基酸残基，螺距约0.54nm（每个残基上升0.15nm，旋转100O）。 相邻的螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与中心轴平行。典型-螺旋一对氢键O与N之间共有13个原子（3.613），前后间隔3个残基。螺旋的走向绝大部分是右手螺旋，残基侧链伸向外侧。R基团的大小、荷电状态及形状均对-螺旋的形成及稳定有影响。3.-折叠(-pleated sheet) -折叠是一种肽链相当伸展的周期性结构。 相邻肽键平面间折叠成110O角，呈锯齿状。 两个以上具-折叠的肽链或同一肽链内不同肽段相互平行排列，形成-折叠片层，其稳定因素是肽链间的氢键。 逆向平行的片层结构比顺向平行的稳定。-螺旋和-折叠是蛋白质二级结构的主要形式。毛发中的-角蛋白和蚕丝中的丝心蛋白是其典型，在许多球蛋白中也存在，但所占比例不一样。胶原蛋白中存在的螺旋结构不同于一般的-螺旋，是由3条具有左手螺旋的链相互缠绕形成右手超螺旋分子。链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向盘绕维持其稳定性。4-转角（-turn）为了紧紧折叠成球蛋白的紧密形状，多肽链180O回折成发夹或-转角。其处由4个连续的氨基酸残基构成，常有Gly和Pro存在，稳定-转角的作用力是第一个氨基酸残基羰基氧（O）与第四个氨基酸残基的氨基氢（H）之间形成的氢键。-转角常见于连接反平行-折叠片的端头。5无规卷曲（random coil）多肽链的主链呈现无确定规律的卷曲。典型球蛋白大约一半多肽链是这样的构象。6超二级结构和结构域超二级结构和结构域是蛋白质二级至三级结构层次的一种过渡态构象。超二级结构指蛋白质中两个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成一特殊的组合体，又称为模体（motif）。通常有，等，例如钙结合蛋白质中的螺旋-环-螺旋模序及锌指结构。结构域是球状蛋白质的折叠单位，是在超二级结构基础上进一步绕曲折叠有独特构象和部分生物学功能的结构。对于较小的蛋白质分子或亚基，结构域和三级结构是一个意思，即这些蛋白质是单结构域的；对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上的相对独立的结构域缔合成三级结构。三、蛋白质的三级结构（tertiary structure）指一条多肽链中所有原子的整体排布，包括主链和侧链。维系三级结构的作用力主要是次级键（疏水相互作用、静电力、氢键等）。在序列中相隔较远的氨基酸疏水侧链相互靠近，形成“洞穴”或“口袋”状结构，结合蛋白质的辅基往往镶嵌其内，形成功能活性部位，而亲水基团则在外，这也是球状蛋白质易溶于水的原因。1963年Kendrew等从鲸肌红蛋白的X射线衍射图谱测定它的三级结构（153个氨基酸残基和一个血红素辅基，相对分子质量为17800）。由AH 8段-螺旋盘绕折叠成球状，氨基酸残基上的疏水侧链大都在分子内部形成一个袋形空穴，血红素居于其中，富有极性及电荷的则在分子表面形成亲水的球状蛋白。四、蛋白质的四级结构 (quaternary structure)有些蛋白质的分子量很大，由2条或2条以上具有独立三级结构的多肽链通过非共价键相互结合而成，称为蛋白质的四级结构。构成四级结构的每条多肽链称为亚基 (subunit)，亚基单独存在时一般没有生物学功能，构成四级结构的几个亚基可以相同或不同。如血红蛋白(hemoglobin,Hb) 是由两个-亚基和两个-亚基形成的四聚体（22）。蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系（一）一级结构是空间构象的基础 （二）种属差异（三）分子病二、蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质的空间结构是其生物活性的基础，空间结构变化，其功能也随之改变。肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）是典型的例子。肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）都能与氧进行可逆的结合，氧结合在血红素辅基上。然而Hb是四聚体分子，可以转运氧；Mb是单体，可以储存氧，并且可以使氧在肌肉内很容易地扩散。它们的氧合曲线不同，Mb为一条双曲线，Hb是一条 S型曲线。在低p(O2)下，肌红蛋白比血红蛋白对氧亲和性高很多，p(O2)为2.8torr(1torr133.3Pa)时，肌红蛋白处于半饱和状态。在高p(O2)下，如在肺部（大约100torr）时，两者几乎都被饱和。其差异形成一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧转运系统。Hb未与氧结合时，其亚基处于一种空间结构紧密的构象（紧张态，T型），与氧的亲和力小。只要有一个亚基与氧结合，就能使4个亚基间的盐键断裂，变成松弛的构象（松弛态，R型）。T型和R型的相互转换对调节Hb运氧的功能有重要作用。一个亚基与其配体结合后能促进另一亚基与配体的结合是正协同效应，其理论解释是Hb是别构蛋白，有别构效应。蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质和氨基酸相似，有两性解离及等电点、紫外吸收和呈色反应。作为生物大分子，还有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。要了解和分析蛋白质结构和功能的关系就要利用其特殊的理化性质，采取盐析、透析、电泳、层析及离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法分离纯化蛋白质。蛋白质的相对分子质量蛋白质的相对分子质量在1万100万，其颗粒平均直径约为4.3 nm（胶粒范围是1100nm）。准确可靠的测定方法是超速离心法，蛋白质的相对分子质量可用沉降系数（S）表示。二、蛋白质的两性解离及等电点蛋白质和氨基酸一样是两性电解质，在溶液中的荷电状态受pH值影响。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点。pHpI时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。在人体体液中多数蛋白质的等电点接近pH5，所以在生理pH7.4环境下，多数蛋白质解离成阴离子。少量蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白的pI偏于碱性，称碱性蛋白质，而胃蛋白酶和丝蛋白为酸性蛋白。蛋白质的紫外吸收蛋白质含芳香族氨基酸，在280nm波长处有特征性吸收峰，用于定量测定。（主要是酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸中的R基团有苯环共轭双键系统）蛋白质的变性及复性蛋白质在某些理化因素的作用下，空间结构被破坏，导致理化性质改变，生物学活性丧失，称为蛋白质的变性（denaturation）。蛋白质变性的本质是多肽链从卷曲到伸展的过程，不涉及一级结构的改变（如加热破坏氢键，酸碱破坏盐键等）。变性作用不过于剧烈，是一种可逆反应，去除变性因素，有些蛋白质原有的构象和功能可恢复或部分恢复，称为复性（denaturation）。蛋白质变性的主要表现是失去生物学活性，如酶失去催化能力、血红蛋白失去运输氧的功能、胰岛素失去调节血糖的生理功能等。变性蛋白溶解度降低，易形成沉淀析出；易被蛋白水解酶消化。蛋白质变性具有重要的实际意义。蛋白质的分离、纯化第二章 核酸的化学DNA的分子结构一、 DNA的一级结构 (primary stucture)DNA的一级结构是指分子中脱氧核苷酸的排列顺序，常被简单认为是碱基序列（base sequence）。碱基序有严格的方向性和多样性。一般将5- 磷酸端作 为多核苷酸链的“头”，写在左侧，如pACUGA（ 5 3） 。 在DNA一级结构中，有一种回文结构的特殊序列，所谓回文结构即DNA互补链上一段反向重复顺序，正读和反读意义相同，经反折可形成“十字形”结构，在转录成RNA后可形成“发夹”样结构，有调控意义。 GCTA GTTCA CTC TGAAC AATT CGAT CAAGT GAG ACTTG TTAA DNA分子很大，最小的病毒DNA约含5000b。1965年Holley用片段重叠法完成酵母tRNAala 76nt 序列测定；1977年Sanger利用双脱氧法（酶法）测定了X174单链DNA5386b的全序列。1990年实施的人类基因组计划（HGP），用15年，投资30亿美元，完成人类单倍体基因组DNA3109bp全序列的测定。该计划由美、英、日、法、德、中六国科学家合作，于2003年提前完成，生命科学进入后基因组时代，研究重点从测序转向对基因组功能的研究。二、DNA的二级结构双螺旋(double helix) 1953年，Watson和Crick根据Wilkins 和Franklin拍摄的DNA X-射线照片（DNA有0.34nm和3.4nm两个周期性变化）以及Chargaff等人对DNA的碱基组成的分析（A=T，G=C，A+G=C+T），推测出DNA是由两条相互缠绕的链形成。Watson-Crick 双螺旋结构模型如下图：1两条反向平行的多核苷酸链形成右手螺旋。一条链为5 3，另一条为3 5。（某些病毒的DNA是单链分子ssDNA）2碱基在双螺旋内侧，A与T，G与C配对，A与T形成两个氢键，G与C形成三个氢键。糖基-磷酸基骨架在外侧。表面有一条大沟和一小沟。3螺距为3.4 nm，含10个碱基对（bp），相邻碱基对平面间的距离为0.34 nm。螺旋直径为2 nm。氢键维持双螺旋的横向稳定。碱基对平面几乎垂直螺旋轴，碱基对平面间的疏水堆积力维持螺旋的纵向稳定。4碱基在一条链上的排列顺序不受限制。遗传信息由碱基序所携带。5DNA构象有多态性。Watson和Crick根据Wilkins 和Franklin拍摄的DNA X-射线照片是相对湿度92%的DNA钠盐所得的衍射图，因此Watson-Crick 双螺旋结构称B-DNA。细胞内的DNA与它非常相似。另外还有A-DNA、C-DNA、D-DNA。1979年Rich发现Z-DNA（左手螺旋、螺距4.5nm、直径1.8nm）三、DNA的三级结构DNA 双螺旋进一步盘曲所形成的空间构象称DNA的三级结构。某些病毒、细菌、真核生物线粒体和叶绿体的DNA是环形双螺旋，再次螺旋化形成超螺旋；在真核生物细胞核内的DNA是很长的线形双螺旋，通过组装形成非常致密的超级结构。 1环形DNA可形成超螺旋 当将线性过旋或欠旋的双螺旋DNA连接形成一个环时，都会自动形成额外的超螺旋来抵消过旋或欠旋造成的应力，目的是维持B构象。过旋DNA会自动形成额外的左手螺旋（正超螺旋），而欠旋形成额外的右手螺旋（负超螺旋）。一段双螺旋圈数为10的B-DNA连接成环形时，不发生进一步扭曲，称松弛环形DNA（双螺旋的圈数=链绕数，即T=L，超螺旋数W=0；L=T+W），但将这一线形DNA的螺旋先拧松一圈再连接成环时，解链环形DNA存在的扭曲张力，可导致双链环向右手方向扭曲形成负超螺旋（T10，L=9，W = -1）。在生物体内，绝大多数超螺旋DNA以负超螺旋的形式存在，也就是说，一旦超螺旋解开，则会形成解链环形DNA，有利于DNA复制或转录。 螺旋具有相同的结构，但L值不同的分子称为拓扑异构体。DNA拓扑异构酶切断一条链或两条链，拓扑异构体可以相互转变。W的正表示双链闭环的螺旋圈在增加，W的负表示减少。L和T的正负表示螺旋方向，右手为正，左手螺旋为负；L值必定是整数。2真核细胞染色体 真核细胞DNA是线形分子，与组蛋白结合，其两端固定也形成超螺旋结构。DNA被紧密地包装成染色体来自三个水平的折叠：核小体、30nm纤丝和放射环。核小体是染色体的基本结构单位，是DNA包装的第一步，它由DNA结合到组蛋白上形成复合物，在电镜下显示为成串的“念珠”状。组蛋白是富含精氨酸和赖氨酸的碱性蛋白质，其氨基酸序列在进化中是高度保守的。组蛋白有5种，H2A、H2B、H3和H4各两分子组成的八聚体是核小体核心颗粒，DNA缠绕其上，相邻核小体间的DNA称为连接DNA且结合H1。200 bpDNA的长度约为68nm，被压缩在10nm的核小体中。压缩比约为7。30nm纤丝是第二级压缩，每圈含6个核小体，压缩比是6。30nm螺旋管再缠绕成超螺旋圆筒，压缩比是40。再进一步形成染色单体，总压缩近一万倍。典型人体细胞的DNA理论长度应是180 cm，被包装在46个5m的染色体中。RNA的分子结构RNA通常以单链形式存在，比DNA分子小得多，由数十个至数千个核苷酸组成。RNA链可以回折且通过A与U，G与C配对形成局部的双螺旋，不能配对的碱基则形成环状突起，这种短的双螺旋区和环称为发夹结构一、转运RNA（transfer RNA，tRNA）1分子量最小的RNA，约占总RNA的15%。主要功能是在蛋白质生物合成过程中，起着转运氨基酸的作用。21965年Holley等测定了酵母丙氨酸tRNA的一级结构，并提出二级结构模型。一级结构特点：核苷酸残基数在7395；含有较多的稀有碱基（如mG、DHU等）；5-末端多为pG，3- 末端都是-CCA。3tRNA的二级结构为“三叶草”形，包括4个螺旋区、3个环及一个附加叉。各部分的结构都和它的功能有关。5端17位与近3端6772位形成的双螺旋区称氨基酸臂，似“叶柄”，3端有共同的-CCA-OH结构，用于连接该RNA转运的氨基酸。3个环是二氢尿嘧啶环（D环）、反密码子环、TC环。419731975年S.H.Kim的X射线衍射分析表明，tRNA的三级结构呈倒L字母形，反密码环和氨基酸臂分别位于倒L的两端。二、信使RNA（messenger RNA，m RNA）1细胞内含量较少的一类RNA，约占总RNA的3%。其功能是将核内DNA的碱基顺序（遗传信息）按碱基互补原则转录至核糖体，指导蛋白质的合成。2种类多，作为不同蛋白质合成的模板，其一级结构差异很大。真核细胞的mRNA有不同于原核细胞的特点：3- 末端有多聚A（polyA）尾，5-末端加有一个“帽”式结构,（m7 Gppp）。 3代谢活跃，寿命较短。三、核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）1约占细胞总RNA的80%。主要功能是与多种蛋白质组成核糖体，是蛋白质合成的场所。2核糖体在结构上可分离为大小两个亚基。原核细胞的rRNA有3种，23S与5S rRNA在大亚基，16S在小亚基。真核细胞有4种rRNA，其中大亚基含28S、5.8S、5S，小亚基只有18S。3. 各种rRNA的一级结构中的核苷酸残基数及其顺序都不相同，且有特定的二级结构。核酸的性质一、一般理化性质1DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末；都微溶于水，不溶于一般有机溶剂。常用乙醇从溶液中沉淀核酸。2具有大分子的一般特性。分子大小可用Da、b或bp、S、链长（m）表示。一个bp相当的核苷酸平均分子量为660Da；1m长的DNA双螺旋相当3000bp或2106Da。3两性电解质。各种核酸的大小及所带的电荷不同，可用电泳和离子交换法分离。RNA在室温下易被稀碱水解，DNA较稳定，此特性用来测定RNA的碱基组成和纯化DNA。4紫外吸收，最大吸收峰在260nm处，核酸的变性或降解，吸光度A升高，称为增色效应。核酸的分离纯化第三章 酶酶的概念和作用一、酶的概念酶是由活细胞合成的，对其特异底物起高效催化作用的生物催化剂（biocatalyst）。已发现的有两类：主要的一类是蛋白质酶（enzyme），生物体内已发现4000多种，数百种酶得到结晶。美国科学家Cech于1981年在研究原生动物四膜虫的RNA前体加工成熟时发现核酶“ribozyme”，为数不多，主要做用于核酸（1989年的诺贝尔化学奖）。二、酶的作用特点酶所催化的反应称为酶促反应。在酶促反应中被催化的物质称为底物，反应的生成物称为产物。酶所具有的催化能力称为酶活性。酶作为生物催化剂，具有一般催化剂的共性，如在反应前后酶的质和量不变；只催化热力学允许的化学反应，即自由能由高向低转变的化学反应；不改变反应的平衡点。但是，酶是生物大分子，又具有与一般催化剂不同的特点。1极高的催化效率 酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。例如，脲酶催化尿素的水解速度是H+催化作用的71012倍；碳酸酐酶每一酶分子每秒催化6105 CO2与水结合成H2CO3，比非酶促反应快107倍。 2高度的特异性酶对催化的底物有高度的选择性，即一种酶只作用一种或一类化合物，催化一定的化学反应，并生成一定的产物，这种特性称为酶的特异性或专一性。有结构专一性和立体异构专一性两种类型。结构专一性又分绝对专一性和相对专一性。前者只催化一种底物，进行一种化学反应。如脲酶仅催化尿素水解。后者可作用一类化合物或一种化学键。如酯酶可水解各种有机酸和醇形成的酯。在动物消化道中几种蛋白酶专一性不同，胰蛋白酶只水解Arg或Lys羧基形成的肽键；胰凝乳蛋白酶水解芳香氨基酸及其它疏水氨基酸羧基形成的肽键。立体异构专一性指酶对底物立体构型的要求。例如乳酸脱氢酶催化L-乳酸脱氢为丙酮酸，对D-乳酸无作用；L-氨基酸氧化酶只作用L-氨基酸，对D-氨基酸无作用。3酶活性的可调节性酶促反应受多种因素的调控，通过改变酶的合成和降解速度可调节酶的含量；酶在胞液和亚细胞的隔离分布构成酶的区域化调节；代谢物浓度或产物浓度的变化可以抑制或激活酶的活性；激素和神经系统的信息，可通过对关键酶的变构调节和共价修饰来影响整个酶促反应速度。所以酶是催化剂又是代谢调节元件，酶水平的调节是代谢调控的基本方式。4酶的不稳定性酶主要是蛋白质，凡能使蛋白质变性的理化因素均可影响酶活性，甚至使酶完全失活。酶催化作用一般需要比较温和的条件（37、1atm、pH7）。三、酶的国际分类与命名（一）酶的分类根据国际酶学委员会（International Enzyme Commission，IEC）的规定，按照酶促反应的性质，分为六大类：1氧化还原酶（oxidoreductases）催化底物进行氧化还原反应。如乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等。2转移酶（transferases）催化底物之间某些基团的转移或交换。如甲基转移酶、氨基转移酶、磷酸化酶等。3水解酶（hydrolases）催化底物发生水解反应。如淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等。4裂解酶（lyases）催化底物裂解或移去基团（形成双键的反应或其逆反应）。如碳酸酐酶、醛缩酶、柠檬酸合成酶等。5异构酶(isomerases) 催化各种同分异构体之间相互转化。如磷酸丙糖异构酶、消旋酶等。6合成酶(ligases) 催化两分子底物合成一分子化合物，同时偶联有ATP的分解释能。如谷氨酰胺合成酶、氨基酸-RNA连接酶等。（二）酶的命名1961年，国际酶学委员会(IEC)主要根据酶催化反应的类型,把酶分为6大类，制定了系统命名法。规定每一酶只有一个系统名称，它标明酶的所有底物与催化反应性质，底物名称之间以“：”分隔，同时还有一个由4个数字组成的系统编号。如谷丙转氨酶的系统名称是丙氨酸：- 酮戊二酸氨基转移酶（酶表中的统一编号是EC2.6.1.2）。乳酸脱氢酶的编号是EC1.1.1.27。酶的作用机制1酶的活性中心酶的活性部位酶的活性部位（active site）是它结合底物和将底物转化为产物的区域，又称活性中心。它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维小区（为裂缝或为凹陷）。酶活性部位的基团属必需基团，有二种：一是结合基团，其作用是与底物结合，生成酶-底物复合物；二是催化基团，其作用是影响底物分子中某些化学键的稳定性，催化底物发生化学反应并促进底物转变成产物，也有的必需基团同时有这两种功能。还有一些化学基团位于酶的活性中心以外的部位，为维持酶活性中心的构象所必需，称为酶活性中心以外的必需基团。构成酶活性中心的常见基团有组氨酸的咪唑基、丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基等。如丝氨酸蛋白酶家族的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶，都催化蛋白质的肽键使之水解，但底物的专一性由它们的底物-结合部位中氨基酸基团的性质所决定，与其作用的底物互补。像胰蛋白酶，在它的底物-结合部位有带负电荷的Asp残基，可与底物侧链上带正电荷的Lys和Arg相互作用，切断其羧基侧；胰凝乳蛋白酶在它的底物-结合部位有带小侧链的氨基酸残基，如Gly和Ser，使底物庞大的芳香的和疏水氨基酸残基得以进入，切断其羧基側；弹性蛋白酶有相对大的Val和Thr不带电荷的氨基酸側链，凸出在它的底物-结合部位，阻止了除Ala和Gly小側链以外的所有其他氨基酸。2 酶的专一性和高效性机制影响酶促反应速度的主要因素底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂、抑制剂二、酶浓度对反应速度的影响当研究某一因素对酶促反应速度的影响时，体系中的其他因素保持不变，而只变动所要研究的因素。当底物浓度远大于酶浓度时，酶促反应速度与酶浓度的变化成正比。 三、底物浓度对酶反应速度的影响 （一）米-曼氏方程式1913年，Michaelis和Menten根据中间产物学说进行数学推导，得出V与S的数学方程式，即米-曼氏方程式。1925年Briggs和Haldane提出稳态理论，对米氏方程做了一项重要的修正。底物浓度对酶促反应速度的影响呈双曲线。当底物浓度较低时，V与S呈正比关系（一级反应）；随着S的增高，V的增加逐步减慢（混合级反应）；增到一定程度，V不再增加而是趋于稳定（零级反应）。当S Km 时，v = Vmax S /Km，反应速度与底物浓度成正比；当S Km 时 ，vVmax，反应速度达到最大速度，再增加S也不影响V。（二）Km的意义1当V/v =2时, Km =S , Km是反应速率v等于最大速率V一半时的底物浓度，单位为摩尔/升（mol/L）。2Km =K2+K3/K1，当K2 K3时，Km值可用来表示酶对底物的亲和力。Km值越小，酶与底物的亲和力越大；反之，则越小。3Km是酶的特征性常数，它只与酶的结构和酶所催化的底物有关，与酶浓度无关。Km和Vmax可用图解法根据实验数据测出。通过测定在不同底物浓度下的Vo，再用1/Vo对1/S的双倒数作图，又称Lineweaver-BurK作图法，即取米氏方程式倒数形式。四、pH对反应速度的影响 每一种酶只能在一定限度的pH范围内才表现活力，酶表现最大活力时的pH称为酶的最适pH。最适pH的微小偏离可使酶活性部位的基团离子化发生变化而降低酶的活性，较大偏离时，维护酶三维结构的许多非共价键受到干扰，导致酶蛋白的变性。酶的最适pH不是固定的常数，受酶的纯度、底物的种类和浓度、缓冲液的种类和浓度等的影响。一般酶的最适pH在48之间，植物和微生物体内的酶最适pH多在4.56.5,而动物体内的最适pH多在6.58，多在6.8左右。但也有例外，如胃蛋白酶最适pH为1.9，胰蛋白酶的最适pH为8.1, 肝精氨酸酶的最适pH为9.0。Vo对pH的关系图形是钟形曲线。五、温度对反应速度的影响温度对Vo关系的图形是一条曲线，它可清楚地表示出最适温度。多数哺乳动物的酶最适温度在37左右，植物体内酶的最适温度在5060。也有些微生物的酶适应在高温或低温下工作。温度从两方面影响酶促反应速率，是升高温度提高反应速率和酶遇热易变性失活两个相反效应间的平衡。六、激活剂对反应速度的影响凡能使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质称为酶的激活剂（activator）。必需激活剂常是金属离子，如Mg2+、K+、Mn2+等, Mg2+是多种激酶和合成酶的必需激活剂；非必需激活剂是有机化合物和Cl-等，如胆汁酸盐是胰脂肪酶，Cl-是唾液淀粉酶的非必需激活剂。七、抑制剂对反应速度的影响使酶活性下降而不导致酶变性的物质称为酶的抑制剂。抑制剂作用有可逆和不可逆抑制两类。以可逆抑制最为重要。 （一） 不可逆抑制作用这类抑制剂通常以共价键与酶活性中心上的必需基团相结合，使酶失活，一般不能用透析、超滤等物理方法去除。这类抑制作用可用某些药物解毒，使酶恢复活性。如农药敌百虫、敌敌畏、1059等有机磷化合物能特异地与胆碱酯酶活性中心的丝氨酸羟基结合，使酶失活，导致乙酰胆碱不能水解而积存。迷走神经兴奋呈现中毒状态。解磷定（PAM）可解除有机磷化合物对羟基酶的抑制作用，显然这类解毒药物和有机磷农药结合的强度大于和酶结合。重金属盐引起的巯基酶中毒，可用络合剂或加入其他过量的巯基化合物，如二巯基丙醇（BAL）来解毒。（二） 可逆抑制作用这类抑制剂通常以非共价键与酶可逆性结合，使酶活性降低或失活，采用透析、超滤的方法可去除抑制剂，恢复酶活性。可逆抑制有竞争、非竞争、反竞争3种类型，以竞争性抑制研究的最多。三种作用的共同点是因Km和Vmax值的变化导致酶促反应初速度下降。竞争性抑制剂的结构与底物类似，且在酶的同一部位（活性中心）和酶结合，仅在加大底物浓度时才逐渐抵消，显然Km值要增加，Vmax不变。非竞争性抑制剂不直接影响酶与底物的结合，酶同时和二者结合生成的中间产物是三元复合物，也无正常产物生成，所以Km不变，而Vmax减小。反竞争抑制剂促进酶与底物的结合，形成的三元复合物也不能形成正常产物，所以Km变小，Vmax也变小。药物是酶的抑制剂。竞争性抑制原理应用范例是磺胺药的研制。磺胺药和细菌合成叶酸所需的对氨基苯甲酸仅一个碳原子之别（变成了S），使细菌的叶酸不能正常合成，导致细菌的核苷酸合成受阻而死亡。而人以摄入叶酸为主，故磺胺药对人的核酸合成无影响。别构酶变构酶(allosteric enzyme)变构酶又称别构酶，是一类调节代谢反应的酶。一般是寡聚酶，酶分子有与底物结合的活性部位和与变构剂非共价结合的调节部位，具有变构效应。引起变构效应的物质称为变构效应剂。降低酶活性的称变构抑制剂或负效应物；反之，称为变构激活剂或正效应物。变构酶与血红蛋白一样，存在着协同效应。共价修饰酶同工酶同工酶（isozymes）具有不同的分子形式但却催化相同的化学反应的一组酶称为同工酶。1959年发现的第一个同工酶是乳酸脱氢酶（LDH），它在NADH存在下，催化丙酮酸的可逆转化生成乳酸。它是一个寡聚酶，由两种不同类型的亚基组成5种分子形式：H4、H3M、H2M2、HM3、M4，它们的分子结构、理化性质和电泳行为不同，但催化同一反应，因为它们的活性部位在结构上相同或非常相似。M亚基主要存在骨骼肌和肝脏，而H亚基主要在心肌。心肌梗死的情况可通过血液LDH同工酶的类型的检测确定。酶的分离与提纯除了采用分离纯化蛋白质的一般方法，如盐析、有机溶剂沉淀、吸附、凝胶过滤、超离心法外，还要注意防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等，以避免酶活力的损失。胞内酶和胞外酶的提取在处理方法上有所不同。胞内酶需要先用捣碎、砂磨、冻融、或自溶等方法将细胞破坏，然后再用适当的分离纯化技术提出。维生素和辅酶p186第五章 糖代谢一 生物体内的糖类二单糖的分解作用1.糖酵解（一）概念和部位糖酵解(glycolysis)是无氧条件下，葡萄糖降解成丙酮酸并有ATP生成的过程。它是生物细胞普遍存在的代谢途径，涉及十个酶催化反应，均在胞液。（二）反应过程和关键酶1.己糖激酶（hexokinase）催化葡萄糖生成G-6-P，消耗一分子ATP。己糖激酶（HK）分布较广，而葡萄糖激酶（GK）只存在于肝脏，这是第一个关键酶催化的耗能的限速反应。若从糖原开始，由磷酸化酶和脱支酶催化生成G-1-P，再经变位酶转成G-6-P。2.G-6-P异构酶催化G-6-P转化为F-6-P。3.磷酸果糖激酶（PFK-）催化F-6-P磷酸化生成F-1，6-DP，消耗一分子ATP。这是第二个关键酶催化的最主要的耗能的限速反应。4.醛缩酶裂解F-1，6-DP为磷酸二羟丙酮和甘油醛-3-磷酸。平衡有利于逆反应方向，但在生理条件下甘油醛-3-磷酸