一个位于6q22的SNP通过调节HOXB13与染色体的结合影响RFX6的表达

A prostate cancer susceptibility allele at 6q22 increases RFX6expression by modulating HOXB13 chromatin binding,2,背景介绍,基本信息前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，是男性泌尿生殖系统的常见恶性肿瘤。美国癌症协会的统计数据显示, 前列腺癌的新发病例数在发达国家男性患者所有肿瘤中占第一位, 死亡率仅次于肺癌。而且在目前所有的癌症中，前列腺癌是遗传率最高的一种。前列腺癌的恶性程度可通过组织学分级进行评估，最常用的是Gleason评分系统，依据前列腺癌组织中主要结构区和次要结构区的评分之和将前列腺癌的恶性程度划分为210分，分化最好的是1+1=2分，最差的是5+5=10分。,前列腺癌,3,背景介绍,临床表现前列腺癌早期常无症状，随着肿瘤的发展，前列腺癌引起的症状可概括为两大类：1.压迫症状逐渐增大的前列腺腺体压迫尿道可引起进行性排尿困难，表现为尿线细、射程短、尿流缓慢、尿流中断、尿后滴沥、排尿不尽、排尿费力，此外，还有尿频、尿急、夜尿增多、甚至尿失禁。肿瘤压迫直肠可引起大便困难或肠梗阻，也可压迫输精管引起射精缺乏，压迫神经引起会阴部疼痛，并可向坐骨神经放射。2.转移症状前列腺癌可侵及膀胱、精囊、血管神经束，引起血尿、血精、阳痿。盆腔淋巴结转移可引起双下肢水肿。前列腺癌常易发生骨转移，引起骨痛或病理性骨折、截瘫。前列腺癌也可侵及骨髓引起贫血或全血象减少。,前列腺癌,4,背景介绍,治疗方法根据肿瘤所处阶段的不同采取不同的治疗方法1.对于早期前列腺癌患者可采用根治性治疗方法，能够治愈早期前列腺癌的方法有放射性粒子植入、根治性前列腺切除术、根治性外放射治疗。2.对于中期前列腺癌患者应采用综合治疗方法，如手术+放疗、内分泌治疗+放疗等。3.对激素敏感型晚期前列腺癌患者以内分泌治疗为主，内分泌治疗的方法包括去势（手术去势或药物去势）和抗雄激素治疗（比卡鲁胺或氟他胺）或去势+抗雄激素治疗。但几乎所有患者最终都会发展为激素非依赖性前列腺癌或激素抵抗性前列腺癌。,前列腺癌,5,背景介绍,预防有研究结果显示番茄和其他含番茄红素的食物对预防前列腺癌可能有效。二项大规模的前列腺癌预防试验结果显示，应用非那雄胺或度他雄胺（治疗前列腺增生的药物）可使前列腺癌的患病率降低25%，但可能增加患高分级前列腺癌的风险。,前列腺癌,6,背景介绍,单核苷酸多态（Single Nucleotide Polymorphisms）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式,但实际上发生的只有两种，即转换和颠换,二者之比为2：1。SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ,原因是CG中的胞嘧啶常被甲基化,而后自发地脱氨成为胸腺嘧啶。,SNP,7,背景介绍,特性1.SNP数量多，分布广泛。据估计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。2.SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基因（biallelic）。 由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。3. SNP等位基因频率的容易估计。4. 易于基因分型。SNPs 的二态性，也利于对其进行基因分型。,SNP,8,实验方法,全基因组关联研究 （Genome-Wide Association Study, GWAS)研究复杂疾病的易感基因 借助于SNP芯片等新技术，科学家可以同时分析一个人的基因组中的上百万个SNP。把许多（上千个）健康人和疾病患者（这些人不一定必须属于同一个家族）的SNP结果放在一起，找出在患者和健康人中allele frequency 显著不同的SNPs。这些SNP即是和疾病发生相关联的。由于分析全基因组SNP，不做其他假设，不受对疾病已有认识的限制，可更有效地了解疾病的遗传致病机制,GWAS,9,背景介绍,GWAS,10,背景介绍,GWAS 方法建立在CDCV假设上.“Common Disease, Common Variant” （CDCV）-复杂疾病的遗传致病因素可以由众多常见SNP（即高频率SNP，allele population frequency 5%）联合组成，每个SNP贡献一定的（较低）致病风险注意低频变异（rare variant）和拷贝数多样性（CNV）造成的遗传致病因素无法用GWAS找到，因目前芯片只有common variant 探针只有找到基因组中更多的rare variant等变异，并设计探针放到芯片上，才能评价CDCV，CDRV哪个更真,GWAS,11,背景介绍,染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）,ChIP,12,背景介绍,13,RESULTS,rs339331定位于6q22，RFX6的intron4中（fig1b）rs339331周围的序列在哺乳动物中高度保守。（fig1c）rs339331位于HOXB13结合位点内（GWAS,fig1d）rs339331位于AR（雄性激素受体）和FOXA1的结合位点内。 由上推测：rs339331位于某个可能具有调控功能的元件内通过生物信息学分析（fig1e）和microwell-well based实验（fig1e）同样得到：rs339331在HOXB13结合位点内，且和T allel结合（fig2a）Online methods分析：AR和FOXA1与该位点直接结合的可能性很低，而HOXB13直接结合的可能性很高。 体外实验和ChIP-seq也印证了这一结论。AS-qPCR（位点特异性PCR）证明：HOXB13与rs339331 T allel在体内也有特异性结合。（fig2b）综上：HOXB13可与rs339331 T allel特异性结合。,一、HOXB13选择性的结合rs339331,14,RESULTS,1. rs339331 alters HOXB13 DNA binding,Nature Genetics 46, 126135 (2014),15,RESULTS,由于该位点所在区域在进化上保守，且在前列腺细胞系中有较高的转录因子占用，所以推测：该区域为一具有细胞型特异性的转录增强子。（fig1d）之后进行ChIP-qPCR和ChIP-seq，显示H3K4甲基化和H3K27乙酰化（fig2a，f）利用PSA做对照，未见明显现象（fig2a）。利用FAIRE技术然后进行qPCR检测前列腺癌细胞中活跃（open）染色质的比例，结果发现该区有高比例的活跃染色质。而在非癌细胞内未见这一现象（fig2g）ENCODE计划的数据显示：LNCap前列腺癌细胞系中，rs339331位于活跃的染色质区。这些（fig1fgi and2bc）HOXB13对rs339331 T allel的偏好性的证据证明了：该区域是一个位点特异性的增强子。为了证明以上推论，采用了enhancer luciferase reporter实验证明rs339331可作为一个enhancer促进luciferase表达（fig2h）,二、rs339331位于一个前列腺癌细胞的细胞型特异性增强子内,16,RESULTS,删除HOXB13结合位点会减弱enhancer活性和对雄性激素受体的刺激反应。综上：说明含有rs339331的区域可作为一个有活性且前列腺细胞型特异性的增强子发挥作用。,17,RESULTS,2.rs339331 resides in a prostate cancer cell type-specific enhancer,Nature Genetics 46, 126135 (2014),18,RESULTS,已知rs339331与RFX6和GPRC6A基因的转录调节相关。基于HGP数据的分析连锁不平衡（LD）分析，RFX6和GPRC6A与rs339331相关（fig3a，top）然而，已知的多个细胞系和组织的基因组数据显示，RFX6只有在转录起始位点有H3K4的甲基化（活跃启动子的标志）（fig3a，bottom）另外ChIP-seq数据显示H3K27乙酰化（活跃染色质的标志）仅仅在RFX6位点出现。 综上：发现RFX6A在样本中高表达，而且GPRC6A未见明显表达，表明RFX6为rs339331所在enhancer的靶基因。检测了中国人口的样本，rs339331位于HOXB13的结合位点内。 猜测：该enhancer通过调节与HOXB13的结合影响了RFX6的表达。为了验证这一猜测，利用siRNA和shRNA把knock down HOXB13，结果显示RFX6表达下调（LNCaP细胞fig3b，22Rv1fig3d）,三、rs339331 通过HOXB13影响了RFX6的表达,19,RESULTS,某些临床数据也印证了这一结果说明RFX6的表达和HOXB13的表达正相关。为了验证RFX6的表达是否和HOXB13的损耗直接相关，利用ChIP发现HOXB13mRNA的损耗的确降低了HOXB13蛋白在rs339331相关区域结合（fig3e）。这样同样会降低AR，还有FOXA1的结合。由于之前证明AR与FOXA1并不直接与该区域结合，猜测：HOXB13通过募集AR与FOXA1形成复合体发挥作用。利用FAIRE-qPCR，评估HOXB13损耗所降低该区染色质活跃程度。综上：RFX6是HOXB13的直接目标。,20,RESULTS,通过提供证据说明HOXB13会结合rs339331的T allel，但是是不是因为这个位点特异性结合导致了导致了RFX6转录的位点不平衡。为了验证，引入一个RFX6的intron14的SNPrs7770158（fig3f），测两个SNP周围的序列，进行独立的分析每个allel信号密集程度，鉴定了在两个细胞系中的一个位点不平衡。说明rs339331的Tallel结合HOXB13是特异的。（fig3f）综上：HOXB13的损耗降低了了HOXB13蛋白与其DNA 结合区域的结合，不能募集AR，FOXA1发挥作用。通过一个luciferase实验证明rs339331结合区域作为一个增强子促进RFX6的转录。综上：rs339331所在的区域通过增强HOXB13与RFX6基因的结合促进转录表达。而且在6q22位点，只有RFX6活跃，说明RFX6是前列腺癌rs339331相关的一个候选基因。,21,RESULTS,3.rs339331 affects RFX6 expression through HOXB13,Nature Genetics 46, 126135 (2014),22,RESULTS,之前发现RFX6与胰腺细胞的分化以及胰岛素的产生相关。现在发现在前列腺癌细胞系组织样品中，RFX6的表达有上调。 由此推测：RFX6在前列腺癌细胞的生长发挥着一个未知的功能为了研究HOXB13促使RFX6表达对细胞的关联，检测了RFX6 knock down对细胞表型的影响。培养抗RFX6和HOXB13的siRNA和shRNA的细胞，细胞生长和生存能力均表现出明显降低。（fig4a）实时监测细胞生长以及电子细胞基质阻抗判断实验（fig4b）结果证明：HOXB13和RFX6均能促进前列腺癌细胞的生长。分别有无人工基底膜，进行体外趋化实验研究细胞的迁移和侵袭能力。转染RFX6siRNA的22rv1细胞的迁移和侵袭能力和对照组相比有明显降低（fig4c-f）,四、RFX6促进前列腺癌细胞的生长和侵袭,23,RESULTS,进行rescue实验表明RFX6的异常表达可使HOXB13 konck down细胞恢复迁移和侵袭能力。过度表达HOXB13同样可以使RFX6 knock down的细胞恢复细胞迁移和侵袭能力。综上：实验结果显示了之前的猜测：RFX6的上调在细胞的迁移中发挥着作用。,24,RESULTS,4.RFX6 promotes cancer cell growth and invasion,Nature Genetics 46, 126135 (2014),25,RESULTS,为了评估RFX6表达上调与前列腺癌发生的相关度，将两个不同来源的肿瘤组织进行qPCR检测RFX6的表达。发现和良性的组织相比，肿瘤组织中RFX6的表达有明显的上调。（fig5a）qPCR分析其他来源的样品，同样发现了这一结论（fig5b，5c）RFX6表达的上调与高Gleason 评分、psa的提高、癌症的复发相关。（fig5d）通过对比，发现RFX6的表达水平和前列腺癌的复发是正相关的（fig5e5f）且GPRC6A未发现明显相关。综上：RFX6表达的上调会使前列腺癌复发风险加大，而且预后更差。,五、RFX6表达对前列腺癌发展的临床效应,26,RESULTS,5.clinical impact of RFX6 expression on prostate cancer progression,Nature Genetics 46, 126135 (2014),27,RESULTS,为了评估RFX6和rs339331变异之间的关系，使用了eQTL(表达数量性状基因座)分析，证实了RFX6表达和rs339331的基因型有很强的相关。为T allel时有RFX6有很强的表达。（fig5g）没有观测到rs339331的基因型与GPRC6A的表达有相关性。证实了之前的推测：rs339331的T allel可以促进RFX6的表达综上：rs339331的T allel增强了HOXB13与RFX6基因的结合，促进表达。且更容易得癌症。（fig5h）,六、rs339331基因型与前列腺癌细胞中RFX6表达相关,28,RESULTS,已知rs339331与RFX6的表达相关，而且RFX6的表达与肿瘤严重程度相关，那么rs339331是否直接与患前列腺癌的个体存活率相关？ 通过分析，rs339331与个体存活率（p=0.3493）rs339331与Gleason 指数（p=0.391）并无直接相关 所以：这些SNP并不能预测疾病的发展 另外，现在的结论可能是由于样本的限制，将来扩大样本量或许能使SNP与疾病的发展联系起来。,七、rs339331的基因型和前列腺癌的严重程度,29,Summary,实验流程：一、HOXB13选择性的结合rs339331二、rs339331位于一个前列腺癌细胞的细胞型特异性增强子内三、rs339331 通过HOXB13影响了RFX6的表达 四、RFX6促进前列腺癌细胞的生长和侵袭 五、RFX6表达对前列腺癌发展的临床效应六、rs339331基因型与前列腺癌细胞中RFX6表达相关七、rs339331的基因型和前列腺癌的严重程度,30,Summ