血细胞计数培训最终

试剂质量检验部王贺,血细胞的分类与计数,血细胞的生成及分化,血液涂片的制备,1、每份样本制作3张血涂片。要求所用玻片清洁、干燥、无尘，大小为25 mm75mm，厚度为0.81.2mm。并有明确标记。如果样本中白细胞数量少时，需要制备更多血涂片（如6张）。2、使用EDTAK2抗凝血液样本时，应在采集后4小时内制备血涂片。在制片前，样本应充分混匀。注意，样本不能冷藏。3、用楔形技术制备血涂片。在玻片近一端1/3处，加一滴（约0.05ml）充分混匀的血液，握住另一张较狭窄的、边缘光滑的推片，以3045角使血滴沿推片迅速散开，快速、平稳地推动推片至玻片的另一端。4、在1小时内，用Romanowsky类型染液染色；或在1小时内，用无水甲醇（含水量3%）固定后染色。,推片技巧,推片倾斜451，推成血膜长度2535mm，宽度1820mm，血膜四周留有空隙区，血膜终尾离玻片终端至少10mm，血膜均匀，薄如蝉翼，尾端形如弧状，迅速扇（摇）干，血膜具有头、体、尾不同厚薄区域。此外，涂片时，还要考虑患者的血液状态，如贫血程度、血液粘稠度、WBC或有核细胞多少等因素，调整推片技巧。,血膜至玻片边缘约5mm,血膜至玻片一端约为总长1/3,血涂片头部，涂片厚,血涂片体部的检查区域,血涂片尾部，涂片太薄,良好血涂片的要求,血膜至少长25mm，至玻片两侧边缘的距离至少为5mm。血膜边缘要比玻片边缘窄，且边缘光滑，适用于油镜检查。血细胞从厚区到薄区逐步均匀分布，末端呈方形或羽毛状。血膜末端无粒状、划线或裂隙。所有这些情况会使白细胞集中在这些区域内。在镜检区域内，白细胞形态应无人为异常改变。通常，随着保存时间的延长，抗凝血会造成白细胞形态的改变，如胞浆内形成空泡，核分解破裂等。应将抗凝血液保存时间的影响减小到最低限度。除部分淋巴细胞增生性疾病外，镜检区域内破损白细胞量应2。无人为污染。,瑞氏染色-姬姆萨（ Wrights-Giemsas）混合染色,瑞氏染色的染料配方浓度对细胞核着色程度适中,细胞核结构和色泽清晰艳丽,对核结构的识别较佳,但对胞浆着色偏酸,色泽偏红,对细胞浆内颗粒特别是嗜天青颗粒及嗜中性颗粒着色较差。 姬姆萨染色对胞浆着色能较好的显示胞浆的嗜碱性程度,特别对嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰, 色泽纯正,而对胞核着色偏深,核结构显示较差。 故采用以瑞氏染液为主，姬姆萨染液为辅的混合染色。,染色步骤,先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖；稍等片刻再加姬姆萨染液2-3滴加减(根据涂片上细胞多少及增升程度酌情而定)； 稍等1-2分钟后,再加磷酸盐缓冲液,加时应缓慢地一滴一滴加在涂片膜上,直至膜面上染色液形成表面张力而终止染色液加入； 染色30-40分钟； 分色：用自来水缓缓冲洗至少3分钟以上,待干，勿用滤纸吸干,以免滤纸纤维污染涂片。,血涂片检查的方法和程序,将血液充分混匀，尽早推成血片并染色。先用低倍或高倍镜观察。了解血片染色和细胞分布情况、有无血小板或红细胞聚集（成串、成堆），尾部有无大型、成堆异常细胞等；继续用油镜在涂片厚薄适中处浏览血片，仔细观察红细胞、白细胞及血小板的形态，并估计其数量。如果观察结果与仪器报告相符，不需进行任何补充试验，即可按仪器测定的结果发出报告。如为贫血或其他血液病患者，其红细胞数量及相关的指标（如MCV、MCH、MCHC）红细胞体积分布宽度（RDW）、直方图或散点图出现异常，则着重观察红细胞的大小、形态、内涵物、着色性、大小一致性以及有无有核红细胞等。如有异常，应加以描述并报告。正常情况下，在血片厚薄适中区域（每个红细胞彼此相互接触但双不重叠），每个油镜视野，约有血小板815个；或每1030 个红细胞见到一个血小板。,血细胞形态检查的临床意义,正常人的血液及造血器官中，各种血细胞的数量有一定的正常范围，不同血细胞及细胞发育的不同阶段有一定形态结构特点。 观察血细胞形态、数量及其比例的变化是诊断造血系统疾病最基本的检查方法。 造血系统疾病，引起血细胞形态学的量和质的改变。血细胞形态学检查为临床提供诊断依据。血细胞形态学检查应包括外周血和骨髓两部分。外周血细胞改变往往反映骨髓病变的重要信息，有利于诊断。,外周血细胞的主要成分,白细胞红细胞血小板,白细胞计数,WBC计数的正常范围：4.010.0109/L; WBC正常限度以下: 轻度减少(4.03.0109/L), 中度减少(3.02.0109/L), 极度减少(10.020.0109/L), 中度增多(20.040.0109/L), 明显增多(40.080.0109/L) 极度增多(80.0109/L)。,白细胞分类,正常成人白细胞分类范围：,外周血中常见的五种白细胞,分叶核细胞大小为1015m。细胞核与细胞浆比率为1:3。细胞呈圆形或卵圆形。细胞核分叶，叶间有丝状连接，分为25叶。核染色质聚集。无核仁。细胞浆染成淡粉红色，含大量特异性颗粒。杆状核细胞大小为1018m。细胞核与细胞浆比率为1:1.51:2。细胞呈圆形或卵圆形。细胞核呈S形，C形,U形或分叶形，可见峡状染色质。核染色质粗颗粒状聚集。无核仁。细胞浆丰富，染成粉红色；含大量特异性颗粒，罕见嗜天青颗粒。,中性粒细胞,“成熟的粒系白细胞，具有弯曲、带状的核形， 核叶间没有线样丝（threadlike filament）形成，称为杆状核；如果连接核叶之间的桥（bridge）内有染色质，这种桥就不算细丝，也是杆状核”；“如果细胞核扭曲（twist）、缠绕，造成一部分核压在另一部分核之上，以至整个核的外形看不清楚，应判为分叶核”,分叶核与杆状核细胞的区分,中性粒细胞的毒性变化,所谓中性粒细胞的“毒性”变化，它是指白细胞在细菌、病毒等抗原，在毒素的刺激下，造成的一种形态学变化。如胞浆内出现“毒性颗粒”、杜尔（Dohle）小体、空泡、脱颗粒以及胞质肿胀等现象；胞核出现固缩（pyknotic）肿胀等。检查这种变化，首先要制备厚薄适中，染色良好的血片。因为血片太厚，细胞缩小，胞质的内容物不易看清；染色太深，会将正常中性粒细胞浆内的颗粒也染得很深而粗，会误认为毒性颗粒；胞质内的空泡和杜尔小体等也被掩盖而不易看清。杜尔小体是一种常在胞浆边缘部出现的淡蓝色小体，实际上是一小块含RNA 的胞质，故亦称RNA 包涵体。此类小体在重度细菌感染的血片中甚多见，但往往被检验者忽略。在EDTA 抗凝血片中杜尔小体往往染呈灰色而不是淡蓝色；如血液储存过久，杜尔小体甚至会消失。 注意，血液在体外如储存过久，粒细胞等胞质内也会出现空泡，核也会扭曲、固缩，会误认为毒性变化。,细胞大小为615m。细胞核与细胞浆比率为5:12:1。细胞呈圆形或卵圆形。细胞核通常呈圆形或卵圆形；偶见核凹陷或轻度切迹。核染色质散在致密或粗颗粒状聚集；副染色质无或少量。无核仁；有时，可见小的、淡的核小体。细胞浆少至中等量；淡蓝色至中度嗜碱性；可见核周淡染区；有时有副核窝；小淋巴细胞无颗粒；大淋巴细胞的细胞浆较多，含少数粗大嗜天青颗粒。异型淋巴细胞细胞大小为1025m。细胞核与细胞浆比率为3:11:2。细胞形态各异，呈圆形，卵圆形或不规则形。细胞核形态各异，呈圆形，卵圆形，凹陷形，折叠形，裂隙形或分叶形。核染色质可以细致、中度致密或粗颗粒；副染色质无或少量。核仁无或多个；大小和染色性各异。细胞浆中等至大量；染灰色、淡蓝色或深蓝色；可见细胞边缘染色深，核周淡染；浆细胞样淋巴细胞常有核周淡染区或核窝；有时可见细小嗜天青颗粒；偶见空泡。,淋巴细胞,异型淋巴细胞,外周血中的淋巴细胞，是一类高度异质性的细胞。在病毒、毒素等抗原的刺激下，其中有一部分会发生增殖并向浆细胞或幼稚细胞（母细胞）转化，从而导致多种多样的形态变化。如细胞体积增大；胞质量变多，蓝染加深，有的含有空胞；核呈不规则的形状，染色质变得疏松，偶尔隐约可见核仁或丝状分裂。凡此种种，经常被一些缺乏经验的检验者误认为是白血病的幼稚细胞。过去由于对这类淋巴细胞的本质了解不够，曾有很多命名。我国统称其为异常淋巴细胞，显然欠妥。因为这类细胞都是正常淋巴细胞对抗原物质的反应，与白血病等出现的恶性（异常）淋巴细胞有根本性区别。目前国外一般称之为不典型淋巴细胞（atypicallymphocytes）, NCCLS则建议称其为变形淋巴细胞（variantlymphocytes）。,细胞大小为1220m。细胞核与细胞浆比率为4:12:1。细胞呈圆形，可有伪足。细胞核形态各异，呈圆形、卵圆形、马蹄形、切迹形或分叶形。核染色质轻度聚集。无核仁。细胞浆含蓝灰色颗粒，少量空泡。,单核细胞,成熟型细胞大小为1315m，幼稚型细胞大小为1018m。成熟型细胞核与细胞浆比率为1:3，幼稚型细胞核与细胞浆比率为1:22:1。细胞呈圆形或卵圆形。细胞核分叶状，通常2-3叶，由细丝状染色质连接。分叶核和杆状核的核染色质致密、块状；幼稚型的核染色质疏松、细致。无核仁。,嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞,细胞大小为1015m。细胞核与细胞浆比率为1:21:3。细胞呈圆形或卵圆形。细胞核分叶状，常被颗粒覆盖。核染色质聚集。无核仁。细胞浆含粗大、致密、深紫色或黑色颗粒。,临床意义,外周血中的红细胞,正常红细胞直径7.27.6mm，厚度2mm圆盘状，两面凹陷，中央较薄，着色较浅，在涂片中形态基本一致。正常RBC在体内能经受通过微血管的严重变形而不受损害。在高度粘稠血液中的RBC变成椭圆形，红细胞膜围绕着所含Hb旋转，像坦克的踏板（Tread）。脾脏可筛选缺乏弹性的红细胞、红细胞异常变形或丧失弹性的红细胞，并加强对这些红细胞的清除。 参考值：成年男性（45.5）1012/L；成年女性（3.55.0）1012/L,红细胞形态学诊断,RBC/Hb、网织RBC、MCV、MCH、MCHC及RBC体积分布宽度（RDW）是判定贫血类型重要依据：,(1)Hb/RBC比值：正常人：Hb/RBC比值为3gHb/L=100万RBC/ L即3:1。AA、溶血性贫血及继发性贫血等属此类。3:1者即为大细胞高色素性贫血,5%。其网织RBC内嗜碱性网织增多，代偿性功能减低者，低于正常水平。多见于AA，但有不典型AA（1/4）患者可有网织RBC增高。网织RBC计数1000个RBC中有多少网织RBC，以其%数表示，是一个比值数，不是绝对值。精确应计算绝对值或用流式细胞仪计数更为确切。 (3)MCV、MCH、MCHC反映RBC病理变化：可将贫血分为大细胞性贫血、正常细胞性贫血、小细胞低色素性贫血及单纯小细胞性贫血（即小细胞性正常色素性贫血），其诊断标准及其病因。,影响RBC形态学人为因素,(1)观察RBC形态一般以外周血涂片较为可靠。 (2)RBC形态与排列（如重叠、缗钱状）与涂片技术、涂片部位及厚薄有很大关系。这点在镜检时应予注意。 (3)即是合格涂片，RBC形态依然与涂片部位及厚薄等多种因素有关：如取涂片中心区域，RBC中心淡染，多 1/3细胞面积大小;取自涂片薄处或尾部，RBC形态误给人以“球形”，失去双凹盘形，中心淡染消失，所谓类球形改变； 取厚片或制片干燥过慢，RBC未摊开，收缩变形，甚至出现人工中心染色过淡等； 取厚片RBC则重叠堆积，呈假“缗钱状”，不便查清形态； 玻片不清洁，油脂过多或骨髓脂肪过多，制片干燥不快，RBC则会形成人工的中心淡染区或空白区。,异常红细胞,外周血中的血小板,血小板是无核细胞，形如圆盘状，直径只有24m，在血中存活10天左右。镜下可见血小板多为圆形或椭圆形，亦有少数梭形及不整形者，可有翻转及布朗运动，一般有13个突起，血小板可分为透明区与颗粒区，二者没有明显分界，颗粒呈深蓝色或蓝绿色折光，散布于颗粒区内，可不断运动，透明区为浅绿色折光。小型血小板占3347；中型血小板占44.349；大型血小板占816；巨型血小板占0.72。,在显微镜下观察悬浮的微粒，或在无风情形观察空气中的烟粒、尘埃时都会看到这种运动。这种运动会随着温度的升高而越激烈。 它是1827年植物学家R-布朗首先发现的。作布朗运动的粒子非常微小，直径约10-710-5米， 在周围液体或气体分子的碰撞下，产生一种涨落不定的净作用力，导致微粒的布朗运动。,什么是布朗运动？,血小板分布情况,功能正常的血小板在外周血涂片上常可聚集成团或成簇。 原发性血小板增多症，血小板集团可以大至占满整个油镜视野。 再生障碍性贫血时，血小板集团明显减少。在血小板无力症，则不出现聚集成堆的现象。,细胞的手工计数,血细胞计数板,计数池的规格,计数池共有9个大方格；每个大方格内分为16中方格，每一中方格又分为25小方格。,细胞计数板使用方法,实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作：1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。3. 计算板四大格细胞总数，压线细胞计数原则（计上不计下，计左不计右）。,细胞悬液充池步骤,红细胞计数的操作方法,2ml红细胞稀释液中加血10l，混匀后，充入计数池，静置35min后，在高倍镜下，计数中央大方格内正中及四角的5个中方格内的红细胞数。,红细胞数/L=N25/5 10 106 200 =N1010 =N/1001012,N：5个中方格内的红细胞数,注意： 1.镜下偶见有两