用于组织工程的种子细胞2010

用于组织工程的种子细胞,选择种子细胞的要求：,采用非侵袭手段或微创手段即可获得的组织；分裂增殖能力强；功能旺盛；无或仅有极微弱的免疫排斥反应；能连续传代，并且传代培养后不发生形态、功能及遗传物质的改变。获得的种子细胞可以接种到受伤降解性支架，再移植到受伤组织。,第一节同种自体、同种异体和异种细胞,自体的种子细胞 :,优点：无免疫排斥，组织相容性好，无伦理学障碍，临床应用好，这是较为理想的细胞来源。 缺点：获得非常有限，尤其是当组织受伤较严重时，或机体条件不佳时，不能保证获得状态良好的细胞；老年人自体细胞的增殖能力较差，形成新组织的能力相对较低；取材时会造成机体的进一步破坏，因而自体细胞在组织工程中不能得到广泛的应用。,同种异体的种子细胞：,优点可由胚胎、新生儿和成年人体的组织中获得，来源广泛，获得容易，可预先库存备用。如果将同种异体细胞经过基因改造，建立无瘤倾向的标准细胞系，则能进行产业化生产。胚胎来源的多种生物制品及细胞因其免疫原性很低，细胞的生命期长，分裂能力强。具有很好的治疗效果优于成体细胞。,缺点需进一步研究其抗原性及进一步采取降低抗原性的措施，如应用免疫隔离技术等。,第一个组织工程产品人工皮肤,1997年3月经美国FDA批准上市 由新生儿的包皮成纤维细胞培植而成，种植在由聚乳酸和聚乙醇酸构成的支架上，呈层状结构，与正常人的皮肤极为相似，能分泌人体皮肤胶原、生长因子和结构性蛋白。,移植数星期后，该支架材料逐渐降解，形成与正常皮肤结构相类似的组织，并与病人自身的皮肤很好地融合，不存在排异反应等，就连病人自身的血管和色素也会逐渐转移到“适移植”活性皮肤中去，愈后不留瘢痕。这种产品可以冻存并运输。,还有另外一种FDA认证的皮肤产品，它同时含有表皮和真皮。该产品的制作是将成纤维细胞混入胶原凝胶中培养后，再在凝胶状混合物上滴加表皮细胞。将该产品移植入患者后，在愈合过程中，部分由患者本身组织所替代，存在于真皮中的成纤维细胞可以分泌胞外基质蛋白，并可以对环境的改变作出反应。体外移植后，可以坚持长达6个月。,异种细胞作为种子细胞的可能性。,由于异种移植存在超急排斥反应，即使克服了超急排斥反应，还需克服急性、慢性排斥反应。为了克服超急排斥反应，已成功地建立了转基因模型。一旦基本克服异种细胞的免疫反应及人畜共患疾病，异种细胞有可能作为组织工程的种子细胞。,第二节干细胞的研究及其在组织工程中的应用,一、干细胞生物工程,干细胞生物工程是指在体外对于细胞进行操作，包括体外增殖、定向诱导、横向分化、基因修饰和组织成形等。利用干细胞构建各种细胞、组织、器官作为移植器官的来源，已经成为干细胞医学生物工程应用的主要方向之一。,由于干细胞工程将改变传统的最为短缺的器官来源问题，科学家预言干细胞极有可能成为治疗目前难以治愈的疾病的新方法。干细胞生物工程是一个宏大的技术体系和项目群，在医药健康领域内是一种辐射力极大的替代性工程技术。,干细胞的基础和应用研究,干细胞的生物学特性和分类干细胞与细胞替代治疗干细胞与基因治疗干细胞与组织工程,内容,干细胞(stem cell)研究的起源,1896年，E. B. Wilson首次用它描述了寄生虫生殖系里的祖细胞。1961年，Till和McCulloch通过对脾集落形成的观察，发现造血干细胞具有多向分化的潜能和自我更新的能力。1981年，英国剑桥大学的Evans和Kaufman用小鼠的内细胞群细胞首次建立了胚胎干细胞系。1998年，美国威斯康星大学的Thomson和约翰霍普金斯医学院的Gearhart同时分别在美国两种权威的科学刊物“科学(Science)”和“美国科学院院报（PNAS)”上发表了人胚胎干细胞的研究报告。,干细胞的定义,简单的讲，干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。从功能上讲，干细胞是一类具有多向分化潜能、自我更新能力的细胞， 是处于细胞系起源顶端的最原始的细胞，在体内能够分化产生某种特定组织类型的细胞。,干细胞的生物学特性,终身保持未分化或低分化特征，缺乏分化标记。在机体的数目、位置相对恒定。具有自我更新能力。能够无限地分裂、增殖。可连续分裂几代，也可长期处于静止状态。具有多向分化潜能，也具有分化发育的可塑性，受所处微环境的影响。分裂的慢周期性，大多数处于G0。通过两种方式生长：对称分裂和不对称分裂。,干细胞的分类,具有与早期胚胎相似的形态特征具有 自我更新和分化形成任何类型细胞的能力有形成完整个体的分化潜能,胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC; 全能干细胞）特点：,胚胎干细胞主要来源胚囊的内细胞团及受精卵发育至桑椹胚之前的早期胚胎细胞从胎儿生殖嵴分离得到的原生殖细胞(EG)也具有ES细胞的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞体细胞核转移至去核卵母细胞后也可以培育出类似胚胎干细胞的全能细胞,1、来源于胚胎内细胞群,2、来源于原始生殖细胞（primordial germ cell,PGC),PGC细胞的分离和培养小鼠胎儿的获取 小鼠胎儿的处理组织块消化细胞培养,PGC细胞的获取,在成纤维细胞上 的生长,PGC细胞的生长行为,体外分化实验,讨论,选择分化抑制物，制备胚胎干细胞饲养层胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的培养、克隆和传代以及培养条件的确定胚胎干细胞鉴定方法的建立,小鼠体细胞核移植技术的初步研究,引言,体细胞核转移是治疗性克隆的关键技术,建立和掌握成熟的体细胞核移植技术，对在临床上成功地进行治疗性克隆的应用非常重要。,本研究以小鼠卵丘细胞为核供细胞，卵母细胞为核受体组成重构胚 , 分别进行了卵丘细胞的分离、分裂中期卵母细胞的去核、供体细胞核的注射、重构胚的电融合以及卵母细胞的活化等研究，以建立和掌握成熟的体细胞核移植技术。,材料和方法,卵丘细胞的分离和卵母细胞的获取去核与移核卵母细胞的活化电融合体外培养,结果,从小鼠的输卵管中获取的卵丘细胞和卵母细胞,从另一小鼠的输卵管中获取的卵丘细胞和卵母细胞,将卵丘细胞核植入卵母细胞后，小鼠胚胎发育进入二细胞期,成体干细胞(somatic stem cell, 多能干细胞和单能干细胞）,造血干细胞骨髓间充质干细胞神经干细胞肝干细胞,肌肉卫星细胞皮肤表皮干细胞肠上皮干细胞视网膜干细胞,成体干细胞在研究和应用方面的优点,可自体移植，避免了免疫排斥不具有无限的自我更新能力，导致细胞“永生化”甚至癌变的可能性很小分化潜能有限，更容易诱导向特定的组织细胞分裂，也可以用于体内组织的原位修复某种类型的成体干细胞有相同种组织的损伤部位迁移的趋势，可作为细胞治疗的定位分离和使用成体干细胞不存在伦理问题,二、干细胞生物工程研究的主要内容,1胚胎干细胞的建系与定向诱导分化 分离人类胚胎干细胞；建立及完善其体外增殖与定向诱导分化的技术；建立胚胎干细胞株；研究转基因或移核胚胎干细胞的增殖与分化及其调控机制；诱导分化细胞的性能分析和鉴定，以及用于组织工程的可行性；其他应用相关研究，如胚胎干细胞的免疫学特点研究。,2造血干细胞工程与造血和免疫重建,不同来源(骨髓、动员外周血、脐带血)造血干细胞的分离纯化；体外扩增与定向诱导分化；造血干祖细胞增殖分化的分子调控机制；造血干细胞的移植与免疫排斥；以及相关的细胞治疗与基因治疗等。,3间充质干细胞与组织损伤修复,分离纯化人体骨髓等组织的间充质干细胞；体外扩增并定向诱导其分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、脂肪、真皮、基质等细胞；对诱导分化细胞的性能进行分析和鉴定；利用现代生物材料对部分组织进行三维重构；并建立其冷冻保存、复苏、建系等相关技术与方法。,4神经干细胞工程与神经损伤修复,利用神经干细胞及体外培养技术结合神经再生支架，探索神经再生的新途径，为神经损伤修复的治疗提供新的更加有效的途径。,5干细胞库,干细胞库是深低温储存干细胞的实验室或登记捐赠者相关资料的机构。分为实物库和资料库。脐血干细胞库就是实物库，它是将新生儿的脐血采集冻存起来，供患者使用。每份脐血中只含几百万个干细胞，仅够幼儿和少年患者使用。对于成年患者，待干细胞扩增技术取得进展后即可解决。骨髓干细胞库可以建为资料库，它只对健康供者进行HIJA配型和资料登记，待需要时再采集骨髓。干细胞库又分为公共库和自体库。,几种研究比较多的干细胞,胚胎干细胞能在体外进行培养传代，保持未分化二倍体状态以及全能性，具有形成嵌合体动物(chimeric animal)的能力，故广泛用于胚胎发育及胚胎工程方面的研究。 如果将胚胎干细胞植入不能发育成个体的四倍体胚胎中，再将该胚胎植入小鼠子宫中，那么可以获得完全是由培养的胚胎干细胞产生的正常个体小鼠。这表明了胚胎干细胞又具有难以置信的全能性。,1、胚胎干细胞,2骨髓间充质干细胞,骨髓细胞有着干细胞的共同特性，可通过体外贴壁培养，或根据细胞表面的特异表达的分子来获得相对较纯的间充质干细胞群，对其进行体外定向诱导，研究它的发育机制或用于临床。骨髓间充质干细胞取材方便且对机体无害，简单的骨髓穿刺即可获得，理论上可以分化为所有的间充质组织类型：骨、软骨、肌肉、肌腱、真皮等。骨髓间充质干细胞由于以上特性而成为基因治疗的良好载体。,3神经干细胞,神经干细胞存在于胚胎和成体脑组织的特定部位，即所谓的神经干细胞岛(islands of NSCs)中，NSCs能够分化出神经元、神经胶质等多种类型的神经细胞。研究表明，这种神经生成机制可以终生维持。,当大脑受伤，某些神经元受损后，NSCs会受诱导而迁移到受损部位，并形成新的神经元来代替受损的神经元以修复大脑，生长为神经细胞。这些新发现，改变了传统的神经元不能再生的看法，为一些神经损伤性疾病带来了希望，,4成肌干细胞,成肌干细胞被看作可以发育为成熟骨骼肌的干细胞。成熟个体骨骼肌中的肌卫星细胞，体外可分化并融合成肌细胞，目前认为是成肌干细胞。 成肌干细胞起源于胚胎发育期神经管两侧的轴旁间充质细胞。 成肌细胞与型胶原凝胶复合, 如果施加周期性应力，管形结构的胶原与成肌细胞能沿管的轴线排列。,四、干细胞在组织工程中的应用,目前的种子细胞在体外培养增殖一段时间后，出现群体生长停滞，虽然通过介入某些病毒基因(如SV40)可使细胞转化并继续增殖，但一段时间后细胞死亡率倍增并伴有染色体的异常。因此干细胞以其高增殖、多向分化能力作为一种新型的种子细胞正备受组织工程的关注。,研究较多的是骨髓基质干细胞或称为骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞的研究,（一）骨髓间充质干细胞的研究进展“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞” “骨髓基质细胞” “间充质干细胞”、“间充质祖细胞”或“骨源性干细胞”,骨髓间充质干细胞是指骨髓基质中含有能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或肌细胞的前体细胞群。这类细胞群具有较强的增殖能力和多分化潜能，并且易于从骨髓中分离及体外扩增纯化，因此，近年来在组织工程领域备受重视 .,20世纪70年代中期，Friedenstein等首次报道，骨髓标本在培养过程发现有贴壁生长的细胞。具有粘附特性 ,细胞是多能的。骨髓间充质干细胞仅占骨髓细胞的0.01万 1万，并随年龄的增加而减少。,培养的骨髓间充质干细胞具备干细胞的两个重要特征：强的自我增殖能力和分化多潜能性。 分化具有可塑性。BMSC的分化多潜能性具有重要的生理意义。,1骨髓间充质干细胞的分离和纯化研究,(1)BMSC密度梯度离心法一次密度梯度离心法 高分子聚蔗糖(商品名Ficoll)和 三碘化合物泛影葡胺组成的淋巴细胞分层液，密度为10770001，能有效地将人的红细胞、粒细胞和单个核细胞分开，成为获得富有淋巴细胞悬液的常规试剂。小鼠淋巴细胞的密度较大，常选用密度为1090的分层液。,连续密度梯度分离法 一般用低密度介质不断稀释高密度介质，即可获得自下而上由高密度到低密度的连续梯度。把密度不同的细胞放在液面上，经高速离心后，就可获得等密度的沉淀环，密度不同的细胞停留在与它们相等的密度层界面。人工合成的聚乙烯吡咯酮包裹的硅胶(商品名Percoll)试剂，可制备连续密度梯度。 可获得4层细胞组分。从上而下依次为：死细胞组分、富含单个核细胞组分、小淋巴细胞组分、红细胞和粒细胞组分。,(2)BMSC流式细胞仪分离法荧光激活细胞分类器(FACS)又称为流式细胞仪。用荧光抗体染色的细胞通过FACS时，该仪器能精确地计数荧光阳性和阴性细胞，并能使各类细胞微滴充电，使之带有不同的电荷。当充电微滴通过电场时，带有不同电荷的荧光阳性细胞和荧光阴性细胞可向不同方向偏离，并被分别收集。特点是速度快，纯度高，细胞活性不受影响。但在MSC的分离上仍然有差别。,(3)免疫磁珠分离法利用细胞表面特异性抗原标记、细胞的单克隆抗体筛选纯化MSC细胞或去除非目的细胞。,2、骨髓间充质干细胞生物学特性鉴定及检测,分化表型逆推，未筛选到特异性标记分子,3、骨髓间充质干细胞在组织工程中的应用,（1）骨髓间充质干细胞向骨组织的诱导分化常用的诱导剂：骨形成蛋白、TGF-、地塞米松、1.25-羟基维生素D3可以自然形成。,诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞碱性磷酸酶阳性反应物呈褐至黑色。上图为MSC培养第10天时检测碱性磷酸酶活性很低。下图为至第40天碱性磷酸酶活性明显升高。,（2）骨髓间充质干细胞向软骨组织的诱导分化,软骨是主要由氨基葡聚糖、型胶原和位于陷窝中的软骨细胞构成的富于弹性的组织。,软骨细胞在体外培养过程中的表型具有不稳定性，正常软骨细胞分泌含有型胶原和大分子量的聚集蛋白多糖的细胞外基质，在经过56次传代后，会出现反分化现象，表现为成纤维样细胞，开始合成工型胶原和小分子量的非聚集蛋白多糖的细胞外基质，因此研究时多采用5代以前的细胞进行。,培养前需将分离出的BMSC低速离心，使细胞形成细胞微团，将此细胞加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入TGF-即可促使骨髓间充质干细胞向软骨分化。,（3）骨髓间充质干细胞向表皮细胞的诱导分化,Korbling等通过对人骨髓移植患者的检测发现，骨髓间充质干细胞在体内可分化为表皮细胞。,将体外培养扩增纯化后的猪骨髓间充质干细胞用5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)进行标记后注射回骨髓供体猪的皮内及皮下，分别于1、2周后取材，常规石蜡包埋后做连续切片，行5一BrdU和角蛋白免疫组织化学染色，进行对比研究发现少数5-BrdU阳性标记细胞出现在表皮的棘层和颗粒层，并同时表达角蛋白。说明在皮肤微环境下骨髓间充质干细胞具有分化为表皮细胞的潜能。,（4）骨髓间充质干细胞向心肌细胞的诱导分化,骨髓间充质干细胞的组织依赖性分化性质能增加梗死区域的心肌细胞数量，改善心功能。骨髓间充质干细胞还具有较强的细胞因子分泌功能，能够促进梗死区的微循环重建，这样可以为移植细胞提供足够的营养支持和满足代谢需要，进一步促进了移植细胞的修复效果。,值得注意的是，部分研究证明，来自骨髓间充质干细胞的新生心肌与原有心肌之间可形成闰盘连接，这也是新生心肌与原有心肌之间共同搏动的基础。用5一氮杂胞苷诱导兔骨髓间充质干细胞，发现可产生含多个长核的肌管的细胞。,（5）骨髓间充质干细胞向脂肪组织的诱导分化,将分离的BMSC用1-methly -3- isobutylxanthine、地塞米松、胰岛素及消炎痛处理，诱导脂肪细胞。成功的标志是细胞内出现富集的脂质小泡，这些细胞表达过氧化物酶增殖激活的受体一2、脂蛋白酯酶及脂肪酶结合蛋白Ap2。约95的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞。这些分化的脂肪细胞在至少3个月的培养中是健康的。,成脂诱导组第10天（倒置显微镜100）,成脂诱导组第21天（倒置显微镜100）,成脂诱导组第10天，油红O染色（倒置显微镜100）,成脂诱导组第21天，油红O染色（倒置显微镜100）,对照组第21天（倒置显微镜100）,对照组第21天，油红O染色（倒置显微镜100）,（6）骨髓间充质干细胞向神经细胞的诱导分化,Kopen等在新生鼠的侧脑室内注射体外培养并标记5-BrdU的BMSC，经过12天后发现注射的BMSC穿越前脑和小脑，到达大脑内。其中的部分BMSC在纹状体和海马的分子层表达神经胶质纤维酸蛋白(GFAP)，并观察到BMSC也能迁移到海马嗅觉小岛、嗅球、小脑内颗粒层等神经元分布丰富的部位，在中脑的网状结构还发现BMSC能最终分化为成熟的星形胶质细胞。,Jiang YH等用含bFGF、的DMEM作为培养基体外培养人和鼠的BMSC，14天后发现培养细胞中产生一定比例的神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 但是由于分化的机制以及调控机制仍不明了，还不能通过人工控制手段在体外得到大量所需要的神经细胞类型。,PD鼠的脑组织中的BrdUrd标记的MSCs分化为神经胶质细胞的免疫组织化学染色的形态学观察，BrdUrd阳性反应物呈黄绿色，GFAP阳性反应物呈紫红色。,在用RA诱导60天后,传代后的一个正在增殖的神经样细胞，伸出较长的突起依靠生长锥的阿米巴运动，在基质上爬行生长。,在用RA诱导50天后,MSCs分化为神经样细胞的扫描电镜观察，可见在新生的细胞胞体上形成的早期的树突样结构，末梢已经开始分支,五、干细胞研究的挑战与机遇,1干细胞的体外培养 干细胞的体外培养有特殊的要求，既能够扩增但又不分化。成体干细胞的来源大都不清楚，其保持潜能性的机制也不清楚；其次缺乏有说服力的特异性标志，难以分离和纯化；如何维持纯化的干细胞在体外扩增时不分化，从理论到实践都很困难。,2干细胞的定向诱导,理论上，干细胞能够分化成多种功能细胞，修复多种组织损伤。人体大约有200多种功能细胞，如何将干细胞诱导为所需的细胞类型，尚需大量的实验尝试，目前已经建立的一些定向诱导体系，令人鼓舞，例如诱导胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞，带来了糖尿病治疗的新希望。骨髓间充质干细胞的定向诱导研究最多，根据报道，可诱导出成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞，甚至某些神经细胞等。,3如何诱导干细胞形成具有一定解剖结构的脏器,在体外发育成一完整的器官，尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官这一目标还需要技术上的突破。 很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。 每个细胞要获得营养和排泄代谢废物，分化的组织中需要产生血管。 器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题,4如何克服移植不良反应,对胚胎干细胞的基因做某些修饰。 结合克隆技术创建病人特异性的胚胎干细胞通过改变HLA基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚，核移植后的卵细胞能否激活沉默基因，启动DNA的合成，会不会改变染色体的结构，胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向，必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的移植的安全性做全面、客观、深入的评价。 胚胎干细胞研究在伦理、道德、法律和宗教方面也遇到很大障碍。,六、发展方向,胚胎干细胞的应用还面临许多问题，所以对它的应用显得较为谨慎。成体干细胞如间充质干细胞、造血干细胞、肌源干细胞的获得就显得比较容易，而且不存在伦理问题，因而目前受到更大的关注。 心脏等器官的发育、形成涉及多个胚层，所以这些器官的组织工程化比较复杂，通过转基因动物克隆器官是一条可行的途径。,第三节细胞永生化及其在组织工程研究中的应用,一、正常细胞的体外培养过程,体外培养的人正常细胞其分裂能力是有限的。经过一定的时期后，它们就会进入一种生长抑制状态(即“衰老”)。,衰老的细胞可见细胞表型和功能的改变。例如，细胞变大、扁平，分泌异常，半乳糖苷酶磷酸化，许多细胞周期蛋白都出现上调等。衰老的细胞可以在体外维持很长时间，而性状不发生改变。它也不同于细胞的静止，静止是一种可逆性变化，适当的刺激例如生长因子会诱导再次增殖。而衰老是不可逆的。,正常细胞经过一定处理后(如：转染原癌基因或SV40病毒等)可使细胞暂时度过衰老期，比未处理的细胞的生命周期延长2060个倍增次数(PD)，然后进入增殖抑制期，即危机期。,首先衰老是正常细胞的表现，只有转化的细胞才有危机期的出现；氚标记培养的衰老细胞可以观察相当长的时间(2天)，只有一小部分细胞核(30)；衰老细胞可以长时间保持这种不增殖状态(46月，甚至2年)。而危机期细胞在46星期之内就会死亡。,增殖抑制与衰老不同,只有少数细胞在一定因素的影响下，端粒酶被激活，以它自身RNA为模板，合成端粒DNA来补充和延长端粒长度，恢复染色体的稳定性。越过危机期细胞，获得无限增殖的能力，细胞即发生永生化。,二、人类细胞永生化,永生化是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖的能力的过程。 通过基因转染等技术，将外源性基因转入目的细胞，或诱导衰老相关基因突变，以增加永生化的发生几率。,首先应用于细胞永生化的是SV40。是20世纪60年代发现的一种猴肾细胞病毒，人为其自然宿主，它由结构蛋白(VP1，VP2， VP3)和两种抗原LT和st组成。,LT抗原为转化启动所必需，对转化起决定作用，是非造血细胞永生化最常用的成分。st抗原对细胞的转化是非必需的，但可起加强作用。两者共同维持转化表型。SV40诱导的永生化细胞已被广泛地应用于体外实验，用以阐明有限生命周期、衰老和永生化的机制。,2放射性因素,x射线、电离辐射、o等放射性因素进行细胞永生化，多可使细胞生命周期得到延伸。推测可能是