DNA的提取方法简介.ppt

DNA的提取方法简介 为了研究DNA分子在生命代谢中的作用 常常需要从不同的生物材料中提取DNA 由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同 要选择适当的材料提取DNA 动植物中 小牛胸腺 动物肝脏 鱼类精子 植物种子的胚中都含有丰富的DNA 微生物中 谷氨酸菌体含7 10 面包酵母含4 啤酒酵母含6 大肠肝菌含9 10 从各种材料中提取DNA方法不同 分离提取的难易程度也不同 对于低等生物 如从病毒中提取DNA比较容易 多数病毒DNA分子量较小 提取时易保持其结构完整性 从细菌及高等动植物中提取DNA难度大一些 细菌DNA分子量较大 一般达2 10道尔顿 因此易被机械张力剪断 细菌DNA 除核DNA外 还有质粒DNA等 1 核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶 DNA则为白色类似石棉样的纤维状物 除肌苷酸 鸟苷酸具有鲜味外 核酸和核苷酸大都呈酸味 DNA RNA和核苷酸都是极性化合物 一般都溶于水 不溶于乙醇 氯仿等有机溶剂 它们的钠盐比游离酸易溶于水 RNA钠盐在水中溶解度可达40g L DNA在水中为10g L 呈黏性胶体溶液 在酸性溶液中 DNA RNA易水解 在中性或弱碱性溶液中较稳定 天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白 DNP 形式存在于细胞核中 要从细胞中提取DNA时 先把DNP抽提出来 再把P除去 再除去细胞中的糖 RNA及无机离子等 从中分离DNA DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同 DNP在低浓度盐溶液中 几乎不溶解 如在0 14mol L的氯化钠溶解度最低 仅为在水中溶解度的1 随着盐浓度的增加溶解度也增加 至1mol L氯化钠中的溶解度很大 比纯水高2倍 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小 在0 14mol L氯化钠中溶解度较大 因此 在提取时 常用此法分离这两种核蛋白 细菌有坚硬的细胞壁 首先要破碎经胞 方法有三种 机械方法 超声波处理法 研磨法 匀浆法 化学试剂法 用SDS处理细胞 酶解法 加入溶菌酶或蜗牛酶 都可使细胞壁破碎 2 细胞的破碎 由于高等动物DNA主要存在于细胞核与线粒体中 所以提取时有两个困难 高等植物与此类似 破碎细胞难 从处死动物 分离组织器宫到破碎细胞费时长 在此时期间DNA可能会被DNase降解 而动物组织 特别是肌肉组织很难破碎 即使是较易破碎的肝 肾等组织也往往使用组织匀浆器 易造成DNA断裂 分子量大 一般比细菌的大2 3个数量级 比病毒的大4 5个数量 对不同生物材料 要根据具体情况选择适当的分离提取方法 3 DNA提取的几种方法 1 浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同 将二者分离 常用的方法是用1M氯纳提取化钠抽提 得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡 使乳化 再离心除去蛋白质 此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间 而DNA位于上层水相中 用2倍体积95 乙醇可将DNA钠盐沉淀出来 也可用0 15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP 再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白 再按氯仿 异醇法除去蛋白 两种方法比较 后种方法使核酸降解可能少一些 以稀盐酸溶液提取DNA时 加入适量去污剂 如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离 在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用 在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂 通常用 15MNaCL 0 015M柠檬钠 并称SSC溶液 提取DNA 2 阴离子去污剂法 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性 可以直接从生物材料中提取DNA 由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合 因为阴离子去污剂能够破坏这种价键 所以常用阴离子去污剂提取DNA 3 苯酚抽提法 苯酚作为蛋白变性剂 同时抑制了DNase的降解作用 用苯酚处理匀浆液时 由于蛋白与DNA联结键已断 蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶 蛋白分子溶于酚相 而DNA溶于水相 离心分层后取出水层 多次重复操作 再合并含DNA的水相 利用核酸不溶于醇的性质 用乙醇沉淀DNA 此时DNA是十分粘稠的物质 可用玻璃漫漫绕成一团 取出 此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 4 水抽提法 利用核酸溶解于水的性质 将组织细胞破碎后 用低盐溶液除去RNA 然后将沉淀溶于水中 使DNA充分溶解于水中 离心后收集上清液 在上清中加入固体氯化钠调节至2 6M 加入2倍体积95 乙醇 立即用搅拌法搅出 然后分别用66 80 和95 乙醇以及丙铜洗涤 最后在空气中干燥 既得DNA样品 此法提取的DNA中蛋白质含量较高 故一般不用 为除蛋白可将此法加以改良 在提取过程中加入SDS 二 从猪脾中提取DNA 1 操作步骤 取鲜猪脾 去脂 血 称取10g 用预冷的1 SSC溶液洗2次 剪碎 按睥 1 SSC 1 5W V加入50ml预冷的1 SSC 用高速组织捣碎机破碎8次 每次5秒 中间间隔30秒 将匀浆液放在烧杯中 于冰盐浴中冷却30分钟 4000转 分钟离心10分钟 充掉上清 沉淀物中再加2倍体积的1 SSC搅匀 离心 弃上清 重复2次 将所得沉淀悬于5倍体积的PH8 0 0 15MNaCL 0 1Na2MEDTA溶液中 边搅拌边漫漫滴加5 SDS最终浓度达1 为止 然后加入固体氯化钠使其最终浓度达1mol L 继续搅60分钟 以确保氯化钠全溶 所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中 加入同体积氯仿 异戊醇 激烈振荡20分钟 4000r离心20分钟 上层水相取出后倒入烧杯 以同积氯仿 异戊醇重复去蛋白2次 取出水相于烧杯中 逐渐加入2倍体积95 乙醇 玻棒搅动 DNA纤维绕于璃玻棒上后挤干 用70 乙醇洗DNA纤维2次 用95 乙醇洗一次 再用乙醚洗一次 取出并挤干 2 实验材料 仪器和试剂 1 实验材料 新鲜猪脾 2 仪器 量筒 1 10 3 100烧杯 2 100 2 250 磨口锥形瓶 1 250 1 500 吸管 1 1 1 10 滴管 玻棒 离心机 电动搅拌器 台秤 剪刀 镊子 3 试剂 20 SSC 175 2gNaCL 88 2g柠檬酸钠 2H2O PH 7 0加水至1000ml 1 SSC 0 1 SSC由 做相应的稀释得来 NaCL Na2EDTA液 8 77gNaCL 3 72gNa2EDTA溶于800ml蒸馏水中 用固体NaOH调PH 8后定容至1000 5 SDS W V 6gSDS溶于100ml45 乙醇中 氯仿 异戊醇 24 1 体积比 其他 95 乙醇 盐冰 数据 DNA重 产率 待测液中测得的核酸 g数DNA 100待测液中制品的 g数 二苯胺显色法测定DNA含量 强酸 加热条件下 可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂 而产生嘌呤碱基 脱氧核糖与嘧啶核苷酸 其中2 脱氧核糖在酸性环境中成为 羟基 酮基戊醛 此物与二苯胺反应生成蓝色化合物 在595nm处有最大吸收 DNA在40 400 g范围内光密度与DNA浓度成正比 在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度 而且其他化合物的干扰也显著降低 当样品含少量RNA时不影响测定 而蛋白质 多种糖及其衍生物芳香 羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质 干扰测定 二苯胺试剂 使用前称取0 8g二苯胺 需在70 乙醇试剂中重结晶2次 溶于180ml冰乙酸中 再加入8ml过氯酸 60 以上 混匀待用 临用前加入0 8ml1 6 乙醛溶液 所配试剂应为无色 每组需56ml共需2800ml DNA标准溶液 须经定磷法确定其浓度 取标准DNA以0 01NNAOH配成200微克 毫升的标准液 每组需12ml共需600ml 1 6 乙醛 取47 乙醛3 4ml 加重蒸水定容至100ml 放于冰箱中 一周之内可以使用 共需70ml 测样品液 准确称取猪脾DNA或用紫外分光法中剩下的DNA液配成10微克 毫升的溶液 每组需4ml共需200ml 操作方法 1 DNA标准曲线的制定 取10支试管 分成2组 依次加入0 4 0 8 1 2 1 6和2 0mlDNA标准溶液 添加蒸馏水 使之都成为2ml 另取2只试管 各加2ml蒸馏水作为对照 然后各加入4ml二苯胺试剂 混匀 于60恒温水浴中保温1h 冷却后于595nm处进行比色测定 取两管平均值 以DNA浓度为横坐标 光吸收值为纵坐标 绘制标准曲线 2 制品的测定 取2