毛细管电泳实验报告.doc

毛细管电泳实验报告高乃群 S080601018实验目的1. 了解毛细管电泳实验的原理2. 掌握毛细管电泳仪的操作方法,并设计样品组分的分析过程.3. 学会处理实验数据,分析实验结果.实验原理CE所用的石英毛细管柱, 在pH3情况下, 其内表面带负电, 和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下, 双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗, 粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和, 正离子的运动方向和电渗流一致, 故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反, 但因电渗流速度一般都大于电泳流速度, 故它将在中性粒子之后流出, 从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。电渗是CE中推动流体前进的驱动力, 它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动, 使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。一般来说温度每提高1, 将使淌度增加2% (所谓淌度, 即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上移动的距离)。降低缓冲液浓度可降低电流强度, 使温差变化减小。高离子强度缓冲液可阻止蛋白质吸附于管壁, 并可产生柱上浓度聚焦效应, 防止峰扩张, 改善峰形。减小管径在一定程度上缓解了由高电场引起的热量积聚, 但细管径使进样量减少, 造成进样、检测等技术上的困难。因此, 加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。实验设备：电泳仪。仪器及试剂：缓冲溶液(buffer)：20 mmol/L Na2B4O7缓冲溶液。1mol/L NaOH溶液，二次去离子水。未知样饮料（雪碧和醒目）1 实验步骤仪器的预热和毛细管的冲洗：打开仪器和配套的工作站。工作温度设置为30，不加电压，冲洗毛细管，顺序依次是：1 mol/L NaOH溶液5 min，二次水5 min，10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4 1:1缓冲溶液5 min，冲洗过程中出口(outlet)对准废液的位置，并不要升高托架。2 混合标样的配制：毛细管冲洗的同时，配制标样苯甲酸浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/ml。3 做标准曲线：待毛细管冲洗完毕，取1 ml混合标样，置于塑料样品管，放在电泳仪进口(Inlet)托架上sample的位置，然后调整出口(outlet)对准缓冲溶液(buffer)，升高托架并固定，然后开始进样。进样压力30 mbar，进样时间5 s。进样后将进口(Inlet)托架的位置换回缓冲溶液(buffer)，切记换回buffer的位置！选择方法2004CE.mtw，修改合适的文件说明，然后开始分析，电压25 kV，时间约10 min。4 未知浓度混合样品的测定：方法与条件同上，测试未知浓度混合样品，分析时间约25min，据苯甲酸钠标准曲线测雪碧与醒目这两种饮料中的苯甲酸钠的含量。5 不同缓冲溶液下迁移时间的变化：未知浓度混合样品的测定完毕后，冲洗毛细管，顺序依次是：1 mol/L NaOH溶液5 min，二次水5 min，然后更换进出口两端的缓冲溶液为20 mmol/L Na2B4O7，冲洗5 min；并在此条件下测试未知浓度混合样品，电压25 kV，时间约10 min。按照前面的顺序再次冲洗毛细管，再次更换进出口两端的缓冲溶液为10 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4 pH为6，冲洗5 min；并在此条件下测试未知浓度混合样品，电压25 kV，时间约15 min。数据处理： 1.下图为苯甲酸钠的标准曲线：浓度（mg/ml)峰面积0.052.585170.16.152340.211.66120.531.9094167.7262按照已知浓度峰的积分面积之比折算未知浓度混合样品中各个组分的浓度（外标定量法）。实验测得：醒目：17.6215 雪碧：31.1271 据标准曲线方程计算醒目中苯甲酸钠为：0.2768 mg/ml；雪碧中苯甲酸钠为0.4739 mg/ml注意事项：1 冲洗毛细管时禁止在毛细管上加电压；不允许更改讲义上给定的工作电压，也不建议改变进样时间。2 样品和缓冲溶液之间的切换是手动的，在实验过程中要随时注意是不是放在正确位置；如果在分析时将样品或者洗涤液当作缓冲溶液，请停止分析并重新用对应缓冲溶液冲洗管路10 min。冲洗毛细管对于实验结果的可靠性和重现性至关重要，务必认真完成每一次冲洗，不允许缩短冲洗时间或者不