细胞培养基的质量控制(定稿)

细胞培养基的质量控制,陈小云中国兽医药品监察所菌种室细胞组2010年6月,前言细胞培养基在生物制药领域的应用国内外对细胞培养基的管理细胞培养基的质量控制,报告内容,前言, 细胞培养基从1903年开始发展 最初：天然组织液血液血清组织提取物体液的化学分析 1950年，199培养基 上世纪60年代，设计出无血清培养基,简单基础培养基, BME (Eagles 基础培养基) EMEM (Eagles 最低必需培养基) GMEM (Glasgows 改良Eagles培养基) DMEM (Dulbeccos改良Eagles培养基) RPMI (Roswell Park Memorial Institute洛斯维公园纪念研究所培养基),BME (Eagles 基础培养基), 最初为培养 mouseL 和 HeLa细胞而设计 在所有合成细胞培养基中使用最广泛的一种 可用于测定正常(WI38)和转化(鼠L和HeLa) 细胞单层的生长反应 BME 是Eagles 最低必需培养基(EMEM or MEM) 和Dulbeccos改良Eagles培养基(DMEM)的前身,EMEM (Eagles 最低必需培养基), 13种氨基酸 8种维生素 6种离子 可补充血清（提供必要的不明成分）,必需氨基酸组氨酸 异亮氨酸亮氨酸赖氨酸甲硫氨酸 (和/或 半胱氨酸)苯丙氨酸 (和/或 酪氨酸)苏氨酸色氨酸缬氨酸,GMEM (Glasgows 改良Eagles培养基), 由lan MacPherson和Michael Stoker发明，以改良EAGLES培养基 该培养基用于研究遗传因子对细胞特性的影响。 该培养基是中BME的基础上，添加10%胰蛋白示磷酸盐和两倍常规浓度的氨基酸和维生素。,DMEM (Dulbeccos改良Eagles培养基), DMEM 最应用最广泛的改良Eagles培养基。 DMEM 是由基础Eagle培养基(BME) 改良而来，含有4倍浓度的氨酸酸和维生素，以及其它补充成分 最初的DMEM 含有1000 mg/L的葡萄糖，最初用于培养鼠胚胎细胞 为培养特定细胞，可将葡萄糖浓度优化为4500。,Renato Dulbecco,因1955年发明DMEM，于1975年获诺贝尔医学奖,RPMI (Roswell Park Memorial Institute), 由lan MacPherson和Michael Stoker发明，以改良EAGLES培养基 该培养基用于研究遗传因子对细胞特性的影响。 该培养基是中BME的基础上，添加10%胰蛋白示磷酸盐和两倍常规浓度的氨基酸和维生素。,细胞培养基在生物制药领域的应用,细胞培养基是以动物细胞大规模培养为技术平台，研发及生产生物药品的关键原材料之一蛋白药物抗体药物人用疫苗兽用疫苗其它新药研发和科学实验等“ 培养基虽不是细胞培养中唯一重要因素，但确实是最重要的一种” Wurm博士，瑞士联邦科技学会生物工艺学教授 2005， Genetic Engineering News,细胞培养基在生物制药领域的应用,2011年全球生物制药市场销售额为1600亿，占据全球制药份额的19%预计2015年生物制药产品的销售额将超过2400亿 生物制药在制药行业比重的增加决定着细胞培养基市场的不断扩大与发展，而生物制药行业的发展趋势也决定着细胞培养基市场的发展趋势。,全球利用生物反应器大规模培养动物细胞生产生物制品的普及率到达80%，均使用个性化（或定制）的细胞培养基。个性化配方（属于非公开、商业秘密）的细胞培养基占世界主要细胞培养基制造商销售额的70-90%；无血清无动物来源成分细胞培养有逐渐取代传统的加血清培养方式的趋势,细胞培养基在生物制药中的重要性,细胞培养基实际上就是生物技术产业的一个“菜篮子”工程，只要用到细胞来做生物技术产品就必须要用到细胞培养基。营养丰富的细胞培养基可以缩短细胞生长周期从而缩短生产周期，可以增加细胞密度、增加收获次数、提高表达量，提高生物制品的产量培养基可能给生物制品带来潜在污染，影响产品的分离纯化，关系到生物制品的质量安全,细胞培养动物疫苗,FDA对细胞培养基的管理,FDA将细胞培养基产品列为医疗器械中的类器械。大多数在美国进行商业销售的医疗器械都是通过上市前通告510(k)的形式得到批准的，对类医疗器械产品（占46%左右），实行的是特殊控制，即企业在进行注册和列名后，还需实施GMP和递交510（K）申请。FDA regards CCM product as type II apparatus in medical apparatus, most medical apparatuses for commerce sales are approved by form of giving public notice 510(k) before they come into the market, the type II medical apparatus (about 46%) was implemented special control, that to say after the enterprise registered it still also implement GMP and submit 510(K) application.,欧盟对细胞培养基的管理,在欧盟，细胞培养基产品作为一种由多种成分混合组成的物质，必须向欧洲化学品管理局（ECHA）注册，才能获准得进入欧盟市场CCM, one material that composed of various ingredients, must register in ECHA can be qualified to enter into European Union market.,生物制药企业对细胞培养基的要求,台湾生物制药企业对细胞培养基生产企业的CGMP稽核依据台湾药品优良制造规范原料药作业基准以及国际医药品稽查协约组织（PIC/S） 的规定对细胞培养基厂商进行cGMP稽核，要求多达 179项条款国内抗体制药企业向美国申报新药的资料中，对细胞培养基的质量要求：明确细胞培养基组分明确原辅料质量标准现场质量体系稽核报告,国内细胞培养基行业的现状,生产企业国内生产企业：8家左右在华销售的国外企业（包括进口分装）：6家左右生产条件：相差较大市售产品有些产品没有标明组分添加动物来源成分物质某些进口细胞培养基产品无有效期进口分装培养基，分装后未经检验就销售,缺少相关专业学历或资质的生产和质量管理人员生产环境简陋检验条件不足，不具备细胞培养基产品全部质量指标的检验条件，也不具备对原材料检验的条件和能力无最终混合的批量概念没有实行GMP管理,国内细胞培养基生产企业存在的问题,没有实现行业管理目前，培养基即不属于药品，也不属于按药品管理的辅料，国家对细胞培养基没有强制性质量标准，也未列入药品生产管理范畴,国内监管存在一定缺失,动物细胞可以耐受的体外环境的各种成分的范围比较窄（下表），所以对与之相关的培养基的质量有必要进行严格的质量控制。,细胞培养基质量控制,细胞类型不同，采用的培养基类型也有差异一般要求 离子： Na, K, Ca, Mg, Cl, P, 磷酸氢根 微量元素：铁，锌， 硒 糖，如葡萄糖 氨基酸 血清; 含有激素和促生长因子同时，含抗生素，细胞生长不需要，但用于控制细菌污染此外，多数培养基含有pH 指示剂，酚红,哺乳动物细胞培养基的基本要求,一、水二、低分子量营养物质能量来源六碳糖丙酮酸盐和核榶谷氨酰胺营养来源（氨基酸）维生素离子微量元素脂类和磷脂前体核酸（DNA和RNA）前体三、无营养物质抗生素缓冲体系酚红保护剂抗氧化剂还原剂,哺乳动物细胞培养基的基本成分,一、水水质是至关重要的水纯化方法反渗透或蒸馏（去除主要的化学物质）活性炭过滤（有机和无机杂质）离子交换（微量的金属或离子）微孔滤膜（微生物污染）评估水的纯度电阻标准：25C时， 20 Mcm,哺乳动物细胞培养基的基本成分,二、低分子量营养物质1、能量来源6碳糖(5-20mM): 除了glucose, 也可以为细胞提供半乳糖和果糖等。在大多数细胞的膜上存在的是Glut1单糖转运载体，同时也有一定数量的Glut2,Glut3等，负责转运其他不同种类的单糖，如果添加其他种类的单糖有助于调节glucose的转运速度，降低lactate的生成，维持pH稳态。但是Glut5仅存在于一些特殊种类的细胞上，负责转运Fructose入胞。丙酮酸盐, 核榶,哺乳动物细胞培养基的基本成分,谷氨酰胺 (1-20mM) ，37度的半衰期t1/2 =8days，终产物是游离的胺类物质，具有细胞毒性;,哺乳动物细胞培养基的基本成分,L-Glutamine属于温度敏感性氨基酸，降解迅速,2、营养来源（氨基酸）主要分为EAA，NEAA,哺乳动物细胞培养基的基本成分,3、维生素,哺乳动物细胞培养基的基本成分,维生素包括：,4、离子,哺乳动物细胞培养基的基本成分,几种常见培养基的离子浓度（M）：,5、微量元素,哺乳动物细胞培养基的基本成分,6、脂肪酸,哺乳动物细胞培养基的基本成分,无血清脂肪酸添加物组合预混试剂,7、核酸,哺乳动物细胞培养基的基本成分,通常不是基础培养基的必需成分当叶酸不足时，可添加嘌呤和胸苷,三、无营养物质 1、抗 生素 细胞生长不需要，但用于控制细菌污染2、缓冲液一般采用碳酸氢根（HCO3），与培养环境中的CO2（510%）共同形成缓冲体系,哺乳动物细胞培养基的基本成分,2、缓冲液通常会向培养基中添加有机缓冲剂HEPES（pH 7.0）,哺乳动物细胞培养基的基本成分,2、缓冲液,哺乳动物细胞培养基的基本成分,培养液pH值与培养环境中CO2压力的关系,3、酚红用作pH指示剂会干扰纯化,哺乳动物细胞培养基的基本成分,4、抗剪切力保护系统,哺乳动物细胞培养基的基本成分,5、抗氧化保护剂,哺乳动物细胞培养基的基本成分,6、还原剂,国家化工行业标准哺乳类动物细胞培养基（HG/T 3935-2007）中的七项检验指标:,细胞培养基质量指标及检测方法,哺乳细胞无血清培养基应符合以下技术要求,细胞培养基质量指标及检测方法,考虑到生物制品的质量和安全性对细胞培养基这种原材料的要求，个人认为，若条件许可，应增加了对细胞培养基中支原体污染、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量检测。,细胞培养基质量指标及检测方法,1、澄清度检查称取每升标示量的实验室样品，置于1L烧杯中，加水1L，搅拌至溶解，按中华人民共和国药典2010版二部附录IX B澄清度检查法进行。2、pH值的测定称取每升标示量的实验室样品，置于1L烧杯中，加水1L，搅拌至溶解，按中华人民共和国药典2010版二部附录VI H pH值测定法进行。3、干燥减重的测定中华人民共和国药典2010版二部附录VIII L干燥失重测定法进行。取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10%。,细胞培养基质量指标及检测方法,4、渗透压的测定称取每升标示量的实验室样品，置于1L烧杯中，加水1L，搅拌至溶解，按中华人民共和国药典2010版二部附录IX G渗透压摩尔浓度测定法进行。取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5%。5、细菌内毒素的测定按中华人民共和国药典2010版二部附录XI E细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。称取1/100每升标示量的实验室样品，精确至0.0001g，加入细菌内毒素检查用水（市售）10ml溶解，吸取该溶液0.1ml加细菌内毒素检查用水（市售）3.9ml，混匀即得试验溶液。,细胞培养基质量指标及检测方法,6、微生物限度的测定按中华人民共和国药典2010版二部附录XI J微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检查法采用平皿法。称取实验室样品1g，精确至0.01g，加入无菌纯化水10ml溶解，混匀即得试验溶液。,细胞培养基质量指标及检测方法,7、细胞生长试验按中华人民共和国药典2010版二部附录XI E细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。7.1 方法提要（以无血清培养基为例）本试验所用器具及溶液均为无菌，试验操作过程均为无菌操作。细胞在37恒温条件下，在不含血清的细胞培养中生长168 h，观察细胞形态并进行细胞计数，计算存活率。7.2 试剂和材料悬浮的CHO-s细胞。细胞培养液：按产品使用说明书要求配制。PBS溶液：称取十二水磷酸氢二钠3.4949g，无水磷酸二氢钾0.2g，氯化钾0.2g，氯化钠8.0g，精确至0.001g； 加纯化水1L，混匀，过滤除菌。 0.4%台盼蓝染色液（工作液的10倍母液）：称取0.4g台盼蓝染料，加100ml PBS溶液溶解，滤纸过滤，4保存。,细胞培养基质量指标及检测方法,7.3 仪器医用净化工作台，洁净级别为百级。CO2培养箱：能在371恒温。三角摇瓶：100ml，无菌。显微镜：倒置、相差。血球计数板。血盖片：与血球计数板配套使用。7.4 试验步骤制备接种细胞悬液