基因多态性分析.doc

.人 基因多态性分析一、实验目的1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。二、实验原理基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reactionRestriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。三、器材与试剂1. 器材离心机。DNA扩增仪。电泳仪。水平电泳槽。紫外检测仪。移液器。2. 试剂口腔拭子DNA抽提试剂盒。琼脂糖。1TAE电泳缓冲液：980ml蒸馏水中加入50TAE母液20ml。50TAE母液：Tris 121g，0.5M EDTA（pH8.0）50ml，冰醋酸 28.55ml，定容至500ml。上样缓冲液（6）：30mM EDTA，40%(V/V)甘油，0.05%（W/V）二甲苯青FF，0.05%（W/V）溴酚蓝。10 mg/ml溴化乙锭（EB）。DNA Marker。四、实验方法1.基因组DNA抽提细胞采集：口腔拭子（消毒后的棉签）擦拭两侧脸颊各10次，采集口腔粘膜脱落细胞，将拭子转置于2mL离心管中，用剪刀将棉签部分剪下，加入DNA抽提试剂盒中的400L缓冲液GA。注意：为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前30分钟内请勿进食和饮水。DNA提取： 参照试剂盒说明书操作。样品保存：DNA产物应保存在-20，以防DNA降解。下次实验再用。2. DNA浓度及纯度检测可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA样品的浓度与纯度。琼脂糖凝胶电泳法定性检测DNA 参照实验16 DNA琼脂糖电泳。紫外分光光度法定量检测DNA浓度及纯度参照实验20 动物肝脏DNA的提取和检测。测定浓度后，稀释至0.25ug/uL备用。3. 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析查找基因序列选择你感兴趣的目的基因，首先查阅文献，如果已有报道并提供了该基因在Genbank中的ID号，可直接在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）中搜索。登陆，先选择核酸数据库，点击下拉框选择Nucleotide，再把Genbank ID号输入搜索框，点击Search，如（图25-1）：图25-1 查找目的基因步骤1如果只是知道基因的名字，则搜索框中输入基因名称，点击search。通常会产生大量的搜索结果，例如搜索人乙醛脱氢酶基因，search后进入如下界面（图25-2），共有700余条结果：图25-2 查找目的基因步骤2真核生物基因通常是断裂基因，含有大量间隔区，序列庞大，若查看全基因序列，可点击Genomic，如果只想获取转录区，点击Transcript查看转录本，点击后进入如下界面（图25-3）：图25-3查找目的基因步骤3一些基因通过转录后加工，通常不止一个转录本，例如此处的ALDH2就有2个，根据你所查阅的文献和这些序列中的解释综合考虑选择你所需要的序列。点击后进入（图25-4）：图25-4 查找目的基因步骤4此页面中有关于该基因信息的详尽描述，可直接到页面底部查看基因序列（图25-5）。图25-5 查找目的基因步骤5设计引物设计引物的常用软件有Primer Premier 5.0，Oligo 6.22等，以及在线设计程序如/cgi-bin/web-primer及NCBI上的Primer Blast等。这些软件能根据引物设计基本原则以及你的需求，设计并推荐最优引物。引物设计后交由商业公司合成。配制反应体系在冰浴中，将以下成分依次加入无菌PCR管中 10PCR buffer 2.5 L dNTP mix （2mM） 2 l 引物1（10pmol） 1 l 引物2（10pmol） 1 l Taq聚合酶 （2U/l）0.2l DNA模板（0.25ug/l） 2L 加ddH2O至25 l，混匀后稍加离心。PCR在核酸扩增仪上预设以下程序，放入PCR管，启动反应。预变性：94，5min变性：94，30sec退火：X，30sec（退火温度通常比引物Tm低5）延伸：72，30sec39 cycle末次循环后延伸：72，10min限制性酶切利用软件Primer Premier 5.0寻找酶切位点，选择相应的限制性核酸内切酶，酶切体系及反应条件参照酶试剂说明书。电泳检测配制3%琼脂糖凝胶，取扩增产物5 -10 ul，进行电泳，同时加DNA分子量标准（DNA Marker）作对照，紫外检测仪下观察并拍照，并分析结果。5.统计与分析根据限制性内切酶位点的有无得到一个1(