微生物学实验讲义.doc

生物学实验微生物（2008级基地班）任课教师： 熊 芳教学时数： 15学时实验周数： 4周 生物学实验教学中心微生物实验目录（15学时）微生物实验基础知识介绍实验一：培养基的配制与灭菌（4学时）实验二：土壤自生固氮菌的分离纯化（5学时）实验三：显微镜的使用和简单染色（3学时）实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时）第一次实验：微生物学实验基础知识一、实验目的1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故；2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识；3.掌握实验报告的正确书写。二、实验内容1.实验室规则；2.实验室安全守则；3.实验室中意外事故处理；4.常用器皿及用具；5.显微镜及有关知识；6.实验预习、实验记录和实验报告。实验一 培养基的配制和高压蒸汽灭菌配置培养基的基本流程如下：原料称量溶解调节pH值过滤澄清分装塞硅胶塞和包扎灭菌培养基的配制原则一、营养成分1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。能源 指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。2. 注意各种营养物质的浓度与配比 营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。 各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（CN）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。二、控制培养基的PH值 各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在7-7.5之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。外源调节：按实际需要流加酸或碱液三、渗透压注意营养物质要有适合的浓度，不能太低满足不了生长的需要，太高则渗透压太大，也会抑制微生物的生长四、氧化还原电位氧化还原电位越高，培养基的氧化活动越强，在厌氧菌培养中，加入还原剂，可降低自由氧的毒害。培养基的种类据组成成分可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。例如，马铃薯蔗糖培养基。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。从培养基的物理状态可分为1.液体培养基：不加凝固剂（常用凝固剂为琼脂）的液体状态培养基。2.固体培养基：在液体培养基中加入1-2%左右的凝固剂的固体状态的培养基或农副产品培养基。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5%凝固剂而成的半固体状培养基。按照培养基的用途，可将其分为1.加富培养基：加富培养基是指在普通培养基里加过血、血清、动物（或植物）组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基，用以培养某种或某类营养要求苛刻的异养微生物。2.选择培养基：选择培养基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基。利用这种培养基可以将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。3.鉴别培养基：普通培养基中加入能与某种代谢产物发生反应的指示剂或化学药品，从而产生某种明显的特征性变化，以区别不同的微生物。牛肉膏蛋白胨培养基的制备一、 实验原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl.其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH值调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g水 1000mlpH 7.47.6。二、 实验器材1、 溶液和试剂 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LnaOH，1mol/LHCl。2、 仪器或其他用具 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.59.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳/皮筋，纱布等。三、 操作步骤1、 称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏，蛋白胨，NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。2、 溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需要的总体积，如果配置固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5%2.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同时进行，节省时间。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断地搅拌，以防琼脂培糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中。3、 调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。pH不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。配置pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解而不能凝固。4、过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。5、分装按实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角烧瓶中。（1） 液体分装 分装高度以试管高度的1/4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。（2） 固体分装 分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的量以不超过三角瓶容积的一半为宜。（3） 半固体分装 试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。分装过程中，注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。6、 加塞 a) 包扎：加塞后，将全部试管用麻绳/皮筋捆好，再外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿塞，其外再用一道麻绳/皮筋扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配置日期。（有条件的实验室，可用市售的铝箔代替牛皮纸，省去用绳扎，而且效果好。）b) 灭菌：将上述培养基以0.103Mpa,121，20min高压蒸气灭菌。c) 搁置斜面：将灭菌的试管培养基冷却至50左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。d) 无菌检查：将灭菌培养基放入37的温室中培养2428h，以检查灭菌是否彻底。阿斯毕无氮培养基甘露醇（或蔗糖、葡萄糖） 10gKH2PO4 0.2gMgSO4.7H2O 0.2gNaCl 0.2gCaSO4.2H2O 0.1gCaCO3 5g琼脂 20g水 1000mlPH 7.07.2 121 灭菌30分钟高压蒸汽灭菌一、目的要求1了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。2学习高压蒸汽灭菌的操作方法。二、基本原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100时，由气态变为液态时可放出226kJ（千焦）的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种，其构造如图。本实验介绍手提式和立式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。三、器材牛肉膏蛋白胨培养基，阿斯毕无氮培养基，培养皿，立式高压蒸汽菌锅等。四、操作步骤1首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。2放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 105kg/cm2，1213，20分钟灭菌。5灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。6将取出的灭菌培养基放入 37温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。五、实验报告1结果检查培养基灭菌是否彻底。2思考题（1）高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降到0时才能打开排气阀，开盖取物？（2）在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？第二次实验：实验二 土壤自生固氮菌的分离和纯化一、实验目的：1、学习微生物的纯系分离、培养方法；2、掌握稀释分离、划线分离、涂抹分离纯化微生物的方法。二、基本原理： 为了生产和科学的需要，往往需要从自然界混杂的微生物群中分离单一的菌种，这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物分离。为了获得某种微生物的纯培养，可采用下列两种方法：一种是提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。如要从土壤中分离自生固氮菌，则培养基中是不能含有N源，这种培养基就比较适合能利用空气中N2的微生物。另一种方法是在培养基中加入某种化学物质，以抑制人们不需要的微生物的生长繁殖。分离土壤中的真菌，往往在分离真菌的马丁培养基中加入适当的孟加拉红、链霉素和金霉素等化学药品，目的在于抑制细菌的生长，这样更有利于获得纯培养。土壤中微生物数量众多，在肥沃土壤中固氮菌数量也很多，自然界中多数氮素养料是有微生物固氮的结果，固氮菌一般可分为自生固氮菌和共生固氮菌两类。要分离自生固氮菌，常用阿斯毕无氮培养基这种选择性培养基，控制其适宜的环境条件，使它在培养基上大量繁殖，然后通过稀释法或划线分离法，使它在培养基上形成单菌落，若分离得不纯，需要进一步纯化，直到得到纯种。三、 实验材料1、 培养基：阿斯毕（Ashby）无氮培养基2、 菜园土3、 灭菌培养皿、镊子、剪刀、接种针、酒精灯等。四、 方法与步骤：（一） 富集培养：（第二次实验做）1、 用已灭菌后冷却至50左右的阿斯毕培养基倒平板。2、 用已灭菌的镊子将黄豆粒大的菜园土摆入已冷凝的平板培养基上。3、 正面放置培养箱中培养，28培养3-4天后，在土粒周围有浑浊半透明的胶状菌落出现，有的在后期会产生褐色的色素。（二） 划线分离纯化：（第三次实验做）1、 用已溶化至50的阿斯毕培养基倒平板；2、 用接种环挑取上述菌落少许，在冷凝平板上进行划线分离，而后置于28培养4天。划线方法如图： A:交叉划线法（1、2、3、4为依次划线的起点）B：连续划线法（1、2为依次划线的起点）（三） 纯化、镜检，得到纯种培养（第四次实验做）1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿斯毕培养基斜面试管中，28培养4天，即获得纯培养菌，可冷冻保存，备用；（要求每人至少保存自生固氮菌的一支斜面试管，并贴好标签。）2、镜检：将斜面菌株进行涂片、染色、镜检。如是粗短杆状或球状的单一形态的菌体细胞较大，常呈单个或“8”字排列，在细胞表面有较厚的荚膜者，即为自生固氮菌。若有杂菌，需要进一步划线纯化。注意事项：1） 微生物分离、纯化这一操作环节，要严格按照无菌操作进行。2） 平板划线时，划线部位不可重叠；3） 划线时，每次都要将接种环上多余菌体烧掉。第四次实验：实验三 显微镜的使用（详见细胞生物实验指导）和细菌的简单染色法一、目的与要求：1学习微生物涂片、染色的基本技术。 2掌握细菌的简单染色法。 3初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。 二、原理： 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。微生物的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。 三、材料 1菌种：大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物。 2染色剂：石炭酸复红染液或草酸铵结晶紫染液。 3仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。 四、流程 涂片干燥固定染色水洗干燥镜检。五、 步骤 1涂片 ：取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸溜水)于玻片中央，用接种环以无菌操作，分别从大肠杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取23环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。 2干燥：室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。 3固定：如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。涂片、干燥和热固定。 4染色：将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液12滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色12min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min。 5水洗： 倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。 6干燥：甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。 7镜检：涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。 六 结果 ： 绘制单染色后观察到的大肠杆菌和藤黄微球菌的形态图。实验四 细菌的革兰氏染色和荚膜染色革兰氏（Gram,s）染色法一、实验原理革兰氏染色法是细菌学上一种重要的鉴别染色法。用这种染色法可以把细菌分为两大类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。该法所用的染料是用两种不同性质的染料草酸铵结晶紫和番红染液。细菌先用草酸铵结晶紫进行初染，经碘液媒染后，再用95乙醇（或丙酮乙醇）脱色，最后用番红复染。如细菌保持草酸铵结晶紫与碘复合物的颜色而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称为革兰氏阳性菌，该反应称为革兰氏阳性或正反应（用G+表示）；如细菌能被乙醇脱色而又能被番红染成红色的称为革兰氏阴性菌，其反应则称为革兰氏阴性或负反应（G-表示）。革兰氏染色反应的机理，初染时,在细胞膜内形成草酸铵结晶紫与碘复合物, G+细胞壁厚,肽聚糖网层次多和交联致密, 95乙醇（或丙酮乙醇）处理时,使网孔缩小,再加上它不含类脂.故乙醇处理后复合物不会溶出缝隙.反之, G-细胞壁薄,外膜层的类脂含量高, 肽聚糖网层次多和交联差,以类脂为主的外膜溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡复合物的溶出.主要是由于两类细菌的细胞壁成分和结构不同，因而对结晶紫碘复合物的渗透性不同，导致了不同染色反应。芽孢杆菌和绝大多数球菌（以及所有的放线菌和酵母菌）都呈革兰氏阳性反应，而大多数无芽孢杆菌弧菌螺旋菌和某些球菌则呈革兰氏阴性反应。因此，革兰氏染色法在细菌的分类鉴定和生产应用上具有重要意义。有些特殊的细菌，革兰氏染色反应不稳定，称为革兰氏不定细菌（Gram variable bacteria）。二、实验材料1第二周分离得到的微生物;2培养24小时的大肠杆菌（E.coli），金黄色葡萄球菌;3载玻片接种环酒精灯及火柴赫克尔（Hucker）氏结晶紫染色液路戈（Lugol）氏碘液95乙醇番红染色液吸水纸显微镜。三、操作步骤（一）涂片1混合涂片法：取一洁净载玻片，滴一小滴蒸馏水于玻片中央。按无菌操作要求，先用接种环挑取少量枯草芽孢杆菌培养物于玻片中央水滴中，涂布均匀。接种环经灼烧灭菌冷却后，再挑取少量大肠杆菌培养物，混涂于玻片中央枯草芽孢杆菌菌液中，制成混合涂片。要求涂片薄而均匀。2三区涂片法：在一洁净载玻片近两端各滴一小滴蒸馏水，按无菌操作要求，先用接种环取少量枯草芽孢杆菌培养