黄曲霉毒素的测定ELISA法.doc

黄曲霉毒素的测定ELISA法测试前请仔细阅读本说明在28冷藏不要冻结1.简介 黄曲霉毒素黄曲霉毒素是一种剧毒且致癌的物质，它是由黄曲霉菌和寄生曲霉菌A的某些菌株产生的。黄曲霉毒素有四种类型：B1，B2，G1和G2。黄曲霉毒素B1是毒性最大且最常有的。最容易产生黄曲霉毒素污染的物质是谷物、花生、棉子、高梁和大多数的树果。动物食入过量黄曲霉毒素的影响从慢性健康直到死亡，已经证明黄曲霉毒素能引起肝损坏或癌症、降低奶和蛋的产出、免疫抑制和干扰再生效率。美国食品药物管理局已经规定了食品和饲料中最大黄曲霉毒素限量。因此，准确测定黄曲霉毒素的含量，对于监测可能发生黄曲霉毒素污染的食品和饲料的质量来说，是非常重要的。测试程序包括仔细的采样、化学提取、卫生学评价和定量分析。美国食品药物管理局已经颁布的黄曲霉毒素限量如下：适用对象限量物质人20ppb除牛奶外的所有食品所有动物20ppb所有饲料（下列除外）除外：种牛，种猪，成熟的家禽100ppb谷物育肥期的猪（100磅）200ppb谷物育肥期的菜牛300ppb谷物育肥期的菜牛、猪、家禽300ppb棉籽粉2.方法原理本测试盒的测试原理是一种竞争性的直接酶联免疫吸附剂测试方法（ELISA），可准确检测出样品中ppb级的黄曲霉毒素。样品和标准控制液中游离的黄曲霉毒素与轭合物中的黄曲霉毒素竞争抗体结合位置。清洗后，加入底物，底物与轭合物反应出现兰色，兰色越深表明黄曲霉毒素越少。将其置于微型孔阅读器中可读出透光度，以控制标准液的透光度作标准曲线，将样品的透光度与标准曲线比较计算出样品中黄曲霉毒素的准确浓度。 3.贮存要求本试剂盒存放在28时，可以一直使用到标签上注明的到期日期。4.试剂与仪器4.1提供的材料48个包被了抗体的孔；48个红色标记的混合孔；4瓶1.5ml浓度为0、5、15、50ppb黄曲霉毒素控制标准液(黄色标签)（甲醇溶液的处理，见注意事项）；1瓶7ml黄曲霉毒素-HRP轭合物溶液(兰色标签)；1瓶24mlK兰底物溶液(绿色标签)；1瓶32ml红色 (红色标签)。4.2需要但未提供的材料70%甲醇溶液；100ml量筒；150ml的具塞三角瓶；滤纸；样品收集具塞试管；漏斗；粉碎机；称量为525克的秤；带450nm滤光片的酶标仪；200l移液器；200l吸咀；纸巾或等效的吸水材料；计时器；防水记号笔；洗瓶；移液器用的试剂槽；蒸馏水或去离子水；12通道移液器5.注意事项甲醇易燃，其容器应密闭并远离热、火花、明火和烟。如果吞下或吸入蒸气，它是有毒的。应避免与皮肤接触。本测试盒不使用时应在28下存放。不要使用过期的测试盒。不要把不同测试盒中的试剂混合使用。遵守正确的移液技术，包括取液前先用该液润洗一次。放置时间与本说明不一致时，可能会出现错误的结果。测试盒应先恢复到室温状态(1830)后才开始使用。避免测试盒在室温下长时间放置。不要使测试盒冻结。应将包括样品提取液在内的所有废液和实验器皿进行处理（如同已被黄曲霉毒素污染一样）。应始终穿戴手套和其它防护服。为了避免交叉污染，每个样品应使用清洁的吸咀和玻璃器皿，并在样品之间彻底清洗所有的玻璃器皿。待测样品的pH值应为68。酸碱过大的样品应进行调整。关于pH值的调整，请技术服务部门联系。每次试验不要超过24孔。6.程序性的提示K-兰底物随时可用，底物为清亮的浅兰色，如果变成了深兰，则弃去。使用时，只倒出所需量到试剂槽中，未用完的不要再倒回试剂瓶中。不使用时应盖住试剂槽，以避免光的照射。7.操作步骤7.1样品制备和提取待测样品应按公认的采样技术采集。样品应磨碎并充分混合后再提取。测试前，将样品在28存放。按以下程序进行：1 将7份分析级甲醇与3份蒸馏水或去离子水混合配成70%的甲醇溶液。取1份代表性样品。研磨样品至至少有75%的样品通过20目的筛子，颗粒尺寸大约相当于细的速溶咖啡。把5克研磨过的样品加入到25ml 70%的甲醇中，然后用力摇动15分钟。用滤纸过滤出至少5ml的提取液。该滤液即为样品的待测液。该待测液即可用于测试。7.2测试程序测试前应将所有的试剂恢复至室温（1830）。7.2.1从箔包中取红色标记混合孔，放在孔架上。7.2.2取同样数量的包被了抗体的孔。把暂不使用的孔放回到箔包中，并重新密封，以保护抗体。7.2.3在使用之前摇动试剂瓶，混合每种试剂。7.2.4从兰色标签瓶内吸取100l轭合物加到每个红色标记的混合孔内。弃去吸咀。7.2.5每次使用新吸咀，吸取100l控制标准溶液和样品液按下列顺序加到红色标记的混合孔内 7.2.6用12道移液器吸入、排出3次使孔内溶液彻底混合，吸取100l加到相应的包被了抗体的孔内，在平的表面上将板前后滑动确保充分混合1020秒钟，不要溅出试剂，混合后于室温下（1830）放置2分钟。7.2.7倒掉包被了抗体孔内的溶液。在每个孔内加满蒸馏水或去离子水，再倒掉，如此重复5次，将板朝下，在吸水材料上拍击以去除所有的水滴。7.2.8从绿色试剂瓶中倒出所需量的试剂到试剂槽中。7.2.9用12道移液器和新吸咀，吸取100l底物加到每个孔内，在平的表面上将板前后滑动确保充分混合1020秒钟。7.2.10混合后放置1.5分钟。倒掉试剂槽中剩余的底物并冲洗试剂槽。7.2.11从红色试剂瓶（终止液）中倒出所需量的试剂到试剂槽中。7.2.12用12通道移液器吸出过量的底物溶液，再吸取100l红色终止液加到每个微孔内，在平的表面上将板前后滑动确保充分混合。7.2.13用干净的布擦净板底，将板置于微型孔阅读器于450nm滤光片下读数。由于气泡会影响结果，应削除溶液中气泡。应在加入终止液后2