生化检测方法汇总

精品文档 1欢迎下载 一 血清谷丙转氨酶 SGPT 赖氏改良法 器材 试管及试管架 移液器或吸量管 恒温水浴锅 721型分光光度计 温度计 动物血清 试剂 1 0 1mol L pH7 4磷酸盐缓冲液 0 1mol L 磷酸氢二钠溶液 称取 Na2HPO414 22g 或 Na2HPO4 2H2O17 8g 溶 解于蒸馏水中 并稀释至1 000ml 4 保存 0 1mol L 磷酸二氢钾溶液 称 KH2PO413 61g 溶解 dH2O 中 稀释至1000ml 4 保存 将0 1mol L 磷酸氢二钠溶液420ml 和0 1mol L 磷酸二氢钾溶液80ml 混和即 为0 1mol L pH7 4的磷酸盐缓冲液 加氯仿数滴 4 保存 2 标准丙酮酸 含丙酮酸2 0 mol mL 取标准丙酮酸钠10mg 用上述缓冲液准确定容为50mL 此液须当日用当日配 3 SGPT底物液 含 酮戊二酸2 mol ml 及 DL 丙氨酸200 mol ml 取 酮戊二酸29 2mg DL 丙氨酸7g 用试剂1溶成100ml 在稀释到刻度前 以 1mol L NaOH 调 pH 7 4 因为转氨酶在 pH7 3以下或7 6以上的环境中酶活性下降 加数滴氯仿防腐 此液于冰箱保存可使用4天 4 GOT 底物液 DL 天冬氨酸200mmol L 酮戊二酸 2mmol L 称取 酮戊二酸 29 2mg 和 DL 门冬氨酸2 66g 置于一小烧杯中 加入1mol L 氢氧化钠20 5ml 使溶解 并 校正 pH 至7 4 然后将溶液移入100ml 容量瓶内 用0 1mol L 磷酸盐缓冲液定容至刻度 放置冰箱内保存 5 2 4 二硝基苯肼溶液 取分析纯2 4 二硝基苯肼19 8mg 用1mol L HCl 溶于100ml 置棕色瓶中保存 6 0 4mol L NaOH 溶液 称取16g 固体 NaOH 用蒸馏水溶解 冷却至室温 定容至1000mL 备用 操作步骤 1 标准曲线绘制 取试管 18 支按下表操作 试 管 号对 照12345 丙酮酸标准液 1 毫升 2 微克分子 00 050 100 150 200 25 SGPT 或 SGOT 底物0 500 450 400 350 300 25 精品文档 2欢迎下载 0 1M 磷酸盐缓冲液 PH7 40 10 10 10 10 10 1 相当于谷丙转氨酶单位0285797150200 相当于谷草转氨酶单位 02461114190 每个样做 3 个平行 置 37 水浴 30 分钟 各管加 2 4 二硝基苯肼液 0 5mL 混匀 再 在 37 水浴中放置 20mL 各管加 0 4mol L 氢氧化钠溶液 5mL 混匀 10 分钟后 从水浴箱 中取出 以蒸馏水调 零 点 用 520nm 波长比色 读取各管之吸光值 各管之吸光值均减 去空白的吸光值 然后以吸光值为纵坐标 各管相应的转氨酶单位为横坐标 绘制成标准曲 线 为了方便 可列出各光度相当于转氨酶单位表 2 酶活性测定 取试管两支 注明测定管及对照管 试剂样品测定 每个样 3 个平行 对 照 每个样 3 个平行 血 清 mL 0 10 1 SGPT 或 SGOT 底物 mL 0 5 置 37 水浴 30 分钟 SGOT 为 37 60 分钟后再加枸橼酸苯胺 1 滴 2 4 二硝基苯肼 mL 0 50 5 置 37 水浴 20 分钟 SGPT 或 SGOT 底物 mL 0 5 NaOH 溶液 mL 5 05 0 对照及样品各做 3 个平行 充分摇匀 静置 10 分钟后 用 520nm 波长比色 以蒸馏水 调节零点 读取吸光值 用样品减去对照吸光值 求得样品的谷丙转氨酶活力 谷丙转氨酶活性单位 精品文档 3欢迎下载 37 pH7 4 每小时每毫升血清催化生成 1 mol 丙酮酸为 1 个单位 例 0 1ml 血清每小时催化生成 0 1 mol 丙酮酸 即相当于 GPT 100U 100ml 血清 注意 1 在测定 SGPT 时 应事先将底物 血清在 37 水浴中 保温 然后在血清管中加入底物 准确记时 2 标准曲线上数值在 20 500U 是准确可靠的 超过 500U 时 需将样品稀释 3 转氨酶只能作用于 L 氨基酸 对 D 氨基酸无 作用 实验室多用 DL 氨基酸 较 L 氨基酸 价廉 若用 L 氨基酸 则用量减半 4 溶血标本不宜使用 因血细胞中转氨酶活力较高 会影响测定效果 5 血清样品的测定需在显色后 30 分钟内完成 6 丙酮酸标准液的浓度要求十分精确 由于丙酮酸开封后易 变质为多聚丙酮酸 而影响丙酮酸标准液的有效浓度而不 易察觉 建议使用质量可靠的市售丙酮酸标准液 7 每批试剂的空白管吸光度上下波动不应超过 0 015A 若有 超出 应仔细检查试剂与仪器方面的问题 8 严重脂血 黄疸 溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血清标本 可增加测定的吸光度 测定这类标本应做血清标本对照管 优点 尽管基质液中余下的 a 酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果 但因其量不多 加之对 505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强 尤其用标准曲 线作测定时 所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正 摈弃了赖氏法一些固有弊端 结 果比其他比色法准确 故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法 1981 年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定 ALT 活性较为合理 缺点 由于 赖氏法设计的底物浓度 如 a 酮戊二酸不足 反应速度只能达到最大速度的 65 显色剂 2 4 二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半 保温 30min 的酶促反应后 新生成的丙酮酸 和未用完的 a 酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题 如此等等 使赖氏法的 重现性较差 在测量精度上仍与连续监测法相差甚大 1 个卡门氏单位的定义是 在温度 25 pH7 4 波长 340nm 光径 1cm 的条件下 1ml 血清使 NADH 的吸光度下降 0 001 的转氨酶活性 国际单位 在最适温度 25 下 1 分钟产生 1 mol 丙酮酸的酶量为 1 个活性单位 即 1IU 1umol min King 法单位定义是 每 1ml 血清在 37 条件下与底物作用 60 min 生 成 1 mol 丙酮酸称为一个单位 Mohun 法单位定义是 每毫升血清在 pH 7 4 37 条件下与底物作用 30 min 每生成 2 5 微克丙酮酸为 1 单位 精品文档 4欢迎下载 二 尿素氮 BUN 二乙酰一肟法尿素测定二乙酰一肟法尿素测定 一 仪器设备 水浴锅 紫外分光光度计 10mL 试管 二 试剂 1 尿素氮试剂 蒸馏水 100mL 浓硫酸 44mL 85 磷酸 66mL 冷却至室温后 加氨基硫脲 50mg 硫酸镉 3CdSO4 8H2O 2g 溶解后稀释至 1000mL 2 20g L 二乙酰一肟试剂 称取二乙酰一肟 20g 加入蒸馏水溶解 定容至 1000mL 3 尿素氮标准贮存液 357mmol L 称取尿素 1 072g 溶解于蒸馏水中定容至 1000mL 至于棕色瓶中贮存 4 尿素氮标准应用液 17 85mmol L 取贮存液 5mL 加蒸馏水定容至 100mL 三 操作步骤 按下面表格的试剂配比操作 试剂测定管标准管空白管 血清 ml 0 02 尿素氮标应用准液 ml 0 02 蒸馏水 ml 0 02 二乙酰 肟试剂 ml 0 50 50 5 尿素氮试剂 ml 5 05 05 0 按上述表的配方每个样做 3 个平行样 混匀 置沸水浴中加热 15min 立即 用自来水冷却 5 分钟 分光光度计选用 540nm 波长 以空白管调零点 读取各 管吸光度 精品文档 5欢迎下载 尿素 mg 测定管吸光度 标准管吸光度 17 85 mg ml 1 此法灵敏度高 用量极微 一般只需 0 02ml 血清即可 本实验是先将血清用生 理水以 1 4 加以稀释再取 0 1ml 故最后计算时 应乘以稀释倍数 5 2 试剂中加入硫胺脲和镉离子 可增进显色强度和色泽稳定性 但仍有轻度褪色现 象 小于 5 h 3 此法操作简单 特异性强 不受其他非蛋白质含氮化合物如尿酸 肌酸等影响 但应控制好实验条件 4 吸管必须校正 使用时务必注意清洁干净 加量务必准确 5 尿液中的尿素氮也可用此法进行测定 由于尿液中尿素氮含量高 标本需用蒸馏水 以 1 50 稀释 如果呈色后吸光度仍超过本法的线性范围 还需将尿液再稀释 重新 测定 3 3 尿素浓度以前习惯用尿素氮表示 尿素分子中含有二个氮原子 因此 尿素浓度以前习惯用尿素氮表示 尿素分子中含有二个氮原子 因此 1mmol L1mmol L 尿尿 素等于素等于 2 2 mmol Lmmol L 尿素氮 世界卫生组织推荐使用尿素 并以尿素氮 世界卫生组织推荐使用尿素 并以 mmol Lmmol L 表示浓度单位 表示浓度单位 我国卫生部也已规定一律使用尿素 不再使用尿素氮一词 我国卫生部也已规定一律使用尿素 不再使用尿素氮一词 尿素氮尿素氮 mg mg 测定管测定管 标准管标准管 0 002 100 0 1 5 0 002 100 0 1 5 测定管测定管 标准管标准管 10 10 参考范围参考范围 5 205 20 mg dlmg dl 三 肌酐 Cr 精品文档 6欢迎下载 四 血糖 Glu 邻甲苯胺法 血糖是指血液中的葡萄糖 葡萄糖与冰醋酸 邻甲苯胺共热时 葡萄糖先 脱水转化为羟甲基糠醛 再与邻甲苯胺缩合为蓝绿色的薛夫碱 其颜色的深浅 与葡萄糖含量成正比 可用比色法进行定量测定 1 仪器 紫外分光光度计 水浴锅 2 试剂 1 葡萄糖标准母液 10mg ml 用饱和苯甲酸溶液配制 2 邻甲苯胺溶液 2 5g 硫脲溶于冰醋酸 加入邻甲苯胺 150ml 及 2 4 硼酸 100ml 用冰醋酸 定容至 1 升 3 操作步骤 1 配置不同浓度葡萄糖标准溶液 取 5 支 10ml 容量瓶 标号 依次加入 葡萄糖母液 0 25 0 5 1 0 2 0 3 0ml 用饱和苯甲酸稀释至 10ml 混匀 则上述溶液 100ml 葡萄糖含量为 25 50 100 200 300mg 2 分别精密吸取不同浓度葡萄糖标准溶液于试管中 设平行管 空白管加 0 1mL 蒸馏水 各管加入邻甲苯胺试剂 5 0mL 混匀后 置沸水中 15 分 钟 立即移入冷水浴中冷却 3 以空白号管调零 于紫外分光光度计波长 630nm 处测吸光值 以各管的 吸光度为纵坐标 相应管中葡萄糖含量 mg 为横坐标 绘制标准曲线 得出线性方程 4 测试样品 取全血 0 1mL 设平行样 按上述方法测出其A630nm吸光值 通过线性方程求出其血糖含量 精品文档 7欢迎下载 试剂 mL 012345 邻甲苯胺试剂 5 05 05 05 05 05 0 不同浓度葡萄糖标准溶 液 00 10 10 10 10 1 蒸馏水 0 100000 100mL 全血相当于葡萄糖 质量 mg 02550100200300 A630nm0 000 注意事项 1 本法不需要除去蛋白质 邻甲苯胺试剂只与醛糖显色 血液中其他还原性 物质基本上无影响 2 邻甲苯胺试剂与葡萄糖显色的深浅及其稳定性与试剂中邻甲苯胺浓度 冰 醋酸浓度 加热时间有关 此法显色稳定 24 小时内无变化 如将加热时间缩 短 生成颜色容易消褪 3 轻度溶血的血清对结果无明显影响 根据推导 血清中含血红蛋白 450 毫 克 100 毫升时 可使测定结果降低约 10 4 高脂血的标本最后显色有时会出现浑浊 影响测定结果 可先制备血滤液 后再行测定 五 血清白蛋白 Alb 溴甲酚绿法 BCG 原理 血清白蛋白在 PH4 2 的缓冲液中带正电荷 在有非离子型表面活性剂存 在时 可与带负电荷的染料溴甲酚绿 BCG 结合形成蓝绿色复合物 在波长 630 纳米处有光吸收峰 其颜色的深浅与白蛋白浓度成正比 与同样处理的白 精品文档 8欢迎下载 蛋白标准比较 可求得血清白蛋白含量 试剂 1 溴甲酚绿 BCG 贮存液 取 BCG 419mg 用 10ml 0 1mol L NaOH 溶解 加 NaN3 100mg 定容至 1000mL 贮于棕色瓶备用 如用溴甲酚绿钠盐应称取 432mg 加水溶解 2 0 1mol L 柠檬酸缓冲液 pH 4 2 分别配制 0 1mol L 柠檬酸和柠檬酸钠 溶液 然后按 12 3 7 7 的体积比例混合 每 1000ml 混合液加入 NaN3 100mg 3 30 聚氧化乙烯月桂醚 Brij 35 溶液 取 Brij 35 30g 加少量水 60 水 浴溶解 加水至 100ml 此可用 Tween 20 或 Tween 80 代替 4 BCG 应用液 BCG 贮存液 250ml 0 1mol L 柠檬酸缓冲液 pH4 2 750ml 30 Brij 35 8ml 也可以用 Tween 20 8ml 或 Tween 80 10ml 代替 混合而成 5 标准蛋白溶液 10mg ml 称取白蛋白 1 00g 用生理盐水 实验操作 1 白蛋白标准曲线绘制 1 稀释白蛋白标准液 分别精密量取白蛋白标准液 0 10 mL 0 20 mL 0 40 mL 0 60 mL 于试管中 再在每个管中依次加入蒸馏水 0 9 mL 0 8 mL 0 6 mL 0 4 mL 混匀 得到稀释后白蛋白标准液含量分别为 1 0 mg ml 2 0 mg ml 4 0 mg ml 6 0 mg ml 2 分别精密量取每个不同浓度稀释白蛋白标准液 0 2mL 于试管中 空白管加 入生理盐水 0 2mL 设平行样 再在每个管中加入 BCG 应用液 5 0mL 混匀 后以空白管调零 立即于紫外分光光度计测吸光值 吸收波长为 620mn 绘 精品文档 9欢迎下载 制标准曲线 得出线性方程 3 样品血清白蛋白测定 用生理盐水按 1 10 的比例稀释血清 取稀释后的 血清 0 2ml 按上述方法测出其吸光值 求得其白蛋白含量 注意事项注意事项 1 BCG 是一种 PH 指示剂 变色域为 PH3 8 显黄色 5 4 显蓝绿色 因此控制反应液的 PH 是本法测定的关键 2 配制 BCG 试剂也可用其他缓冲液如枸椽酸盐或乳酸盐缓冲液 但以琥 珀酸缓冲液的校正曲线通过原点 线性好 灵敏度高 成为首选推荐配方 3 试剂中的 Brij 35 也可用其他表面活性剂代替 如吐温 20 或吐温 80 终浓度为 2ml 灵敏度和线性范围不变 4 当白蛋白标准与 BCG 结合后 溶液光径 1 在 630 处测定的吸光度应 为 0 811 0 035 如达不到此值 表示灵敏度较差 5 蛋白质标准液是一个复杂的问题 实验证明 BCG 不但与白蛋白呈色 而且与血清中多种蛋白质成分呈色 其中以球蛋白 运铁蛋白 结合珠蛋白 更为显著 其反应速度较白蛋白稍慢 由于 30S 内呈色对白蛋白特异 故 BCG 与血清混合后 在 30S 内读取吸光度 可明显减少非特异性呈色反应 为了减少本法基质效应的影响 最好用参考血清作标准 1 本法操作简便 快速 胆红素 溶血和中度脂血无干扰 既可手工操 作 也能自动化分析 是目前国内测定血清白蛋白的最常用方法 2 本法线性范围 10 60g L RCV 4 但该法与溴甲酚紫法比较 对血 清白蛋白特异性稍差 六 血清总蛋白 TP 双缩脲法 原理 血清中蛋白质分子的肽键与双缩脲试剂中的 Cu 结合形成紫色化合物 精品文档 10欢迎下载 其色度与总蛋白的浓度成正比 在 546 波长下进行比色测定 实际上凡是 分子内含有两个氨基甲酰基 CONH2 的化合物 不论直接相连或是通过 一个氮或碳原子间接连接 均能与双缩脲试剂发生反应 蛋白质分子内含 有许多肽键 CONH2 因此可用双缩脲法作比色测定 但应注意的是不 仅仅是 CONH2 凡含 CSNH2 C NH NH2 或 CH2NH2 等基团而具有 累似结构的化合物对双缩脲试验亦呈阳性 所以本反应并非为蛋白质所特 有 但在体液中 除蛋白质外实际上不存在可与双缩脲试剂显色的物质 各种血浆蛋白质 包括病理的和正常的 呈色的程度基本相同 因此在血 浆蛋白的比色测定中 双缩脲反应是比较理想的方法 仪器 紫外分光光度计 水浴锅 电子天平 试剂 1 10 氢氧化钠溶液 称取 10 00g 氢氧化钠 用蒸馏水溶解 冷却至室 温后 定容至 1L 备用 2 双缩脲试剂 取 1 50g 硫酸铜和 6 0g 酒石酸钾钠 用 500mL 水溶解 在搅拌下加入 300mL10 氢氧化钠溶液 1 0g 碘化钾 用水稀释到 1000mL 避光保存 此试剂可长期保存 若贮存瓶中有黑色或暗红色 沉淀出现 则需重新配制 3 标准蛋白溶液 10mg mL 牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液 酪蛋白用 0 05moL L 氢氧化钠溶液配制 作为标准用的蛋白质要预 先用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量 根据其纯度称量 配制成标准 溶液 4 待测蛋白质溶液 待测血清按 1 10 倍数稀释 待用 注意样品浓度 不要超过 10mg ml 精品文档 11欢迎下载 操作方法 1 标准曲线的测定 精密吸取 0 mL 0 2 mL 0 4 mL 0 6 mL 0 8 mL 1 0mL 的标准蛋白质溶液于试管中 分别依次加入蒸馏水 1 0mL 0 8mL 0 6mL 0 4mL 0 2mL 0mL 设平行样 然后加入 4mL 双缩脲试剂 充分摇匀后 37 水浴 10min 以空白管调零点 在 540nm 波长处测定吸光值 以蛋白质的含量为横坐标 光吸收值为纵 坐标绘制标准曲线 2 样品的测定 用上述同样的方法 测定稀释的待测血清的蛋白质浓度 注意 1 样品中总蛋白含量超过 100 0g L 则用生理盐水稀释后测定 结果乘以稀释 倍数 2 试剂浑浊变色不能用 3 试剂使用后立即盖紧瓶盖 1 白蛋白 球蛋白 1 5 2 5 1 通过计算其比值可以判定肝脏的功能情况 2 总蛋白升高 脱水 皮肤大面积烧伤 发烧 腹泻 呕吐 3 总蛋白降低 大量输液将机体血浆稀释 某些水肿性疾病 长期营养不 良和消耗性疾病 4 球蛋白大量降低 机体免疫功能降低 精品文档 12欢迎下载 七 总胆固醇 TCH 八 甘油三酯 TG 九 酪氨酸多巴氧化酶活性测定 多巴色素法 1 仪器设备 紫外分光光度计 离心机 秒表 2 试剂 1 0 10mol L 磷酸缓冲液 pH6 0 50mL0 20mol L Na2HPO4 与 22mL0 1mol L HCl 混合 稀释至 200mL 2 0 010mol L 多巴溶液 称取 0 195g 多巴 用 pH6 0 磷酸缓冲液溶解 并定容至 100mL 3 实验方法 取 0 1mL 待测液于试管中 加入 2 9mL pH6 0 缓冲液 再加入 2mL 多巴溶 液 立即摇匀于 480nm 波长下测吸光值 开始 6min 内每分钟读一次数 以后 各 2min 读一次数 直至吸光度变化不大为止 以吸光度对时间作图 从直线 斜率求出酶活性 设平行样 同样方法测 0 2mL 和 0 3mL 待测液的吸光值 求 出酶活力 试样中酶活力计算公式 k V 106 待测样品的酶活性 k 吸光值对时间作出的直线斜率 多巴溶液的摩尔吸收系数 L g cm 精品文档 13欢迎下载 V 待测样品的体积 mL 十 十 SODSOD 的测定方法的测定方法 1 试剂的配制 1 0 05mol L 磷酸缓冲液 PBS pH7 8 A 母液 0 2mol L 磷酸氢二钠溶液 取 Na2HPO4 12H2O 分子量 358 14 71 7g 用蒸馏水溶解并定容至 1000mL B 母液 0 2mol L 磷酸二氢钠溶液 取 NaH2PO4 2H2O 分子量 156 01 31 2g 用蒸馏水溶解并定容至 1000mL 0 05mol L PBS pH7 8 的配制 分别取 A 母液 Na2HPO4 228 75mL B 母液 NaH2PO4 21 25mL 用蒸馏水定容至 1000mL 2 14 5mM 甲硫氨酸溶液 Met 取 2 1637g Met 用磷酸缓冲液 pH7 8 定 容至 1000ml 3 30 M EDTA Na2 溶液 取 0 001gEDTA Na2 用磷酸缓冲液定容至 100mL 4 60 M 核黄素溶液 取 0 0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至 100mL 避光 保存 5 2 25mM 氮蓝四唑 NBT 溶液 取 0 1840g NBT 用 PBS 定容至 100ml 避光 保存 2 酶活性测定 1 反应混合液配制 以 60 个样为准 分别取 Met 溶液 162mL EDTA Na2溶 液 0 6mL 磷酸缓冲液 5 4mL NBT 溶液 6mL 核黄素溶液 6mL 混合后摇匀 2 分别取 3ml 反应混合液和 30 L 酶液于试管中 精品文档 14欢迎下载 3 将试管置于光照培养箱中在 4000 lux 光照下反应 20min 同时做两支对照管 其中 1 支试管取 3mL 反应混合液加入 30 L PBS 不加酶 液 照光后测定作为最大光还原管 另 1 支只加缓冲液置于暗中测定时用于调 零 4 以不照光的对照管 只有缓冲液并置于暗处 调零后 避光测 A560 出现 颜色即可测定 5 酶活性计算 SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原 50 所需酶量 测的样 品值要在最大管的一半左右才合适 否则要调整酶量 为 1 个酶活单位 U SOD 总活性 Ack AE V 1 2Ack Vt 式中 Ack为照光对照管的吸光度 AE为样品管的吸光度 V 为样品液总体积 ml 1 6ml 加入 PBS 的体积 Vt为待测样 ml 30ul 十一 十一 CATCAT 过氧化氢酶 的测定方法 过氧化氢酶 的测定方法 1 试剂配制 0 15mol L 磷酸缓冲液 pH7 0 取 A 母液 Na2HPO4 457 5 ml 和 B 母液 NaH2PO4 292 5 ml 混合后用蒸馏水定容至 1000ml 2 酶活测定 1 反应液配制 取 200ml PBS 0 15M pH7 0 加入 0 309ml 30 的 H2O2 原液 摇匀即可 2 样品测定 以 PBS 为对照调零 取 3ml 反应液加入 0 1ml 可视情况 调整 样品液 立即测定 A240 紫外 1min 测一次 连续 4min 3 酶活性计算 以每 min OD 值减少 0 01 为 1 个酶活性单位 u CAT u mL min A240 Vs 0 01 t 精品文档 15欢迎下载 式中 A240 为反应时间内吸光度的变化 T 为反应时间 min Vs 为测定时样品液体积 ml 十二 十二 MDAMDA 的测定方法的测定方法 1 试剂配制 1 5 TCA 三氯乙酸 5 0gTCA 用蒸馏水定容至 1000ml Cm mol L 2 0 5 TBA 2 硫代巴比妥酸 2 5g 用 TCA 定容至 500ml 避 光 2 操作方法 取待测样 2mL 和 3ml0 5 TBA 混合后在沸水浴煮沸 1515min 然后迅速冷却 4500r min 离心 10min 用蒸馏水为空白调零 分别测定上清液在 450nm 532nm 和 600nm 处的吸光值 3 计算组织中 MDA 含量 MDA 浓度 C mol L 6 452 OD532 OD600 0 559D450 十三 谷胱甘肽过氧化物酶 十三 谷胱甘肽过氧化物酶 GSHGSH PxPx 活力测定方法 活力测定方法 原理 谷胱甘肽过氧化物酶 GSH Px 是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制 自由基反应的系统 对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要 其活力以 催化 GSH 氧化的反应速度 及单位时间内 GSH 减少的量来表示 GSH 和 5 5 二硫对硝基苯甲酸 DTNB 反应在 GSH Px 催化下可生成黄色的 5 硫代 2 硝基 苯甲酸阴离子 于 423nm 波长有最大吸收峰 测定该离子浓度 即可计算出 GSH 减少的量 由于 GSH 能进行非酶反应氧化 所以最后计算酶活力时 必须 精品文档 16欢迎下载 扣除非酶反应所引起的 GSH 减少 1 试剂和仪器 仪器 可见光分光光度计 低温高速离心机 恒温水浴锅 微量加样器 试剂 1 叠氮钠磷酸缓冲液 pH7 0 分别称取 NaN316 25mg EDTA Na27 44mg Na2HPO4 1 732g NaH2PO41 076g 加入蒸馏水溶解至 100mL 用少 量 HCL NaOH 调 pH7 0 4 保存 2 1mmol L 谷胱甘肽 还原型 GSH 溶液 称取 GSH 30 7mg 加叠氮钠磷 酸缓冲液至 100mL 临用前配制 冰冻保存 1 2 天 3 1 25 1 5mmol L H2O2溶液 取 30 H2O2 0 15mL 0 17mL 用双蒸水稀 释至 100mL 作为贮备液 4 避光保存 临用前将贮备液用双蒸水稀释 10 倍 即可 4 偏磷酸沉淀液 称取 16 7gHPO3 先用蒸馏水溶解 0 5gEDTA 280gNaCl 加蒸馏水溶解至 1000mL 用普通滤纸过滤 室温保存 5 0 32mol LNa2HPO4溶液 称取 22 7gNa2HPO4加蒸馏水至 500mL 室温 保存 6 DTNB 显色液 称取 40 0mgDTNB 1 000g 柠檬酸三钠加蒸馏水溶解至 100mL 4 避光保存 1 个月 2 实验步骤 1 3 6 2 3 1 样品制备 溶血液 取鼠血 10 l 加入到 1mL 双蒸水中 充分振摇 使之全部溶血 1 100 待测 4h 内测定酶活力 若当天来不及测定 将肝素抗凝全血置 20 冻存 3d 内测定 若 4 存放 28h 内必须测完 测前取出样品室温自然解冻 精品文档 17欢迎下载 组织上清液 动物禁食过夜 处死后 立即取出所需脏器 放入冷生理盐 水中洗去浮血 剔除脂肪及结缔组织 滤纸吸干后 在冰浴上剪成碎块 称取 适量组织 加冷 0 2M 磷酸缓冲液 以 20000r min 匀