发热伴血小板减少综合征研究进展合肥

“发热伴血小板减少综合征”研究进展,李德新中国CDC病毒病所,2009-2010年， 在湖北、河南和山东等地一些丘陵、山区相继出现病因不明症状类似的病人，主要表现为发热、消化道症状、血小板减少、白细胞减少及多脏器功能损伤等,少数重症病例死亡。,临床症状,实验室检测,70例确诊病例出血表现,鉴定新病毒,非序列依赖单引物扩增(SISPA)技术 首批测定了576个克隆，发现14个布尼亚科病毒样核酸序列，包括L片段、M片段和S片段编码区和非编码区基因序列 用RACE等技术测定全基因组序列 布尼亚病毒科白蛉热病毒属的新病毒,病毒分离和形态学特征,SFTS病毒颗粒,病毒与患者血清的免疫反应,用Vero细胞从湖北、山东、河南等6省市SFTS患者标本中分离到18株病毒，蜱中分离到3株，病毒与患者血清有特异性免疫反应。具有布尼亚病毒形态特征,病毒形态,新布尼亚病毒基因组特征,NSm ?,L、M和S片段基因遗传进化分析,与已知白蛉病毒属病毒编码氨基酸差别显著,系统发生分析,实验室诊断方法,一、核酸检测 荧光定量PCR 传统PCR二、抗体检测 IgM(捕获法ELISA、免疫层析、IFA) IgG(间接法ELISA、IFA) 总抗体(双抗原夹心法ELISA)三、抗原检测,L片段,M片段,传统RT-PCR检测患者标本,Real-time PCR检测新病毒核酸,L,疑似患者血清224 份，病毒核酸阳 性率68.4%，检出天数：3-15天 200份疫区健康人血清标本，病毒核酸均阴性 180份实验室血清库健康人血清病毒核酸均阴性 148份确诊其他疾病患者血清标本，病毒核酸均阴性。,M,S,荧光定量PCR的临床研究结果,阳性组 阴性组 合 计 阳性 147 0 147 阴性 2 354 356 合计 149 354 503 灵敏度 98.66 特异度 100,IFA检查患者血清抗体,重组抗原制备,一、原核细胞表达、纯化病毒核蛋白、NSs蛋白,SFTSV核蛋白在昆虫细胞表达,转染sf9细胞（P3代）与病人血清反应,制备抗原、抗体，建立检测方法,检测新布尼亚病毒抗体,双抗原夹心ELISA法,基于重组抗原的MacELISA,利用原核和真核表达体系，纯化、制备病毒特异性抗原。获得一批人源、鼠源抗新布尼亚病毒单克隆抗体，鼠、兔多克隆抗体。完成抗体修饰标记和评价，建立了检测病毒特异性IgM、IgG和总抗体的ELISA，IFA，FA，胶体金免疫层析法。建立和初步评价了检测病毒中和性抗体的微量中和，空斑减少中和方法,病人双份血清IgG抗体阳转或4倍以上升高,病人双份血清中和抗体阳转或4倍以上升高,病毒抗原检测,单克隆抗体,采用噬菌体表面展示技术，已经获得一批人源抗新布尼亚病毒单克隆抗体 制备了抗新布尼亚病毒核蛋白和包膜糖蛋白的鼠单克隆抗体,实验室检测方法,宿主和媒介,一、从蜱中分离到数株新布尼亚病毒二、蜱病毒核酸检出率较高三、从羊、狗血清中分离到病毒四、从羊、狗和牛血清中检测到病毒核酸五、从羊、牛、狗和猪血清中检出病毒抗体六、从啮齿动物中检出病毒核酸和抗体,家畜抗体检测,一、鼠组织中SFTSV抗原二、鼠血清中SFTSV抗体,啮齿动物感染调查,免疫荧光检测鼠脑SFTSV抗原,人-人传播,From a to f: Index Patient, ICU Doctor, Consultant Doctor, Younger Son, Older Son and Mortuary Beautician,* Samples collected in acute phase range from 1 -10 days after onset- Negtive + Weak positive + Positive,聚集性病例的病原学检测,Phylogenetic Analysis of SFTSV isolated from this cluster and other strains previously isolated in China,L,M,S,No./Total(%),*Medical care workers in ICU and close contacts,动物模型和发病机制,SFTS病毒分别经不同途径接种小鼠，接种后第三天出现出血小板计数减少、白细胞减少。 不同地区、不同患者标本分离的SFTS病毒接种实验动物出现类似结果，但是程度有差别 攻击后动物一些器官出现病理变化，一些器官发现病毒抗原。,动物模型和发病机制,接种SFTSV,0 1 3 5 7 10 14 21 28 (Day),在不同时间点处死小鼠进行分析: 血小板和血细胞计数; 血液病毒载量; 血清抗体免疫应答反应; 脾细胞免疫应答反应; 病理学特征性改变.,动物血液和组织中病毒载量,病毒攻击后的血小板减少和白细胞减少,动物的细胞和体液免疫,(A,D) PBS 对照组; (B,C) 病毒感染组, 20x; (E,F) 病毒感染组, 40x.,SFTSV感染小鼠的病理改变,肾: 肾小球系膜细胞增生，肾小球充血，未见炎细胞侵润。肝: 肝细胞变性和炎性细胞聚集;脾: 病毒染色阳性细胞为巨噬细胞样细胞。,Pathologic features in the early phase of the infection,Spleen: Lymphocyte depletion (Day 1) Increased megakaryocyte (Day 3),Pathologic features in the late phase of the infection,Kidney: Glomerular hypercellularity, mesangial thickening, congestion, absence of inflammation(Day 14)Liver: Hepatocyte degeneration and necrosis (Day 14),Macrophage marker: F4/80.,脾脏和肾脏巨噬细胞增加,脾脏巨噬细胞病毒抗原阳性,Anti-N protein monoclonal antibody (Green). Macrophage marker: F4/80 (Red).,Virus positive monocytes located in red pulp of spleen,20X 20x,40x,Increased clearance of platelet by splenic macrophage,Platelet marker: CD62P (Green fluorescence and IHC). Macrophage marker: F4/80 (Red fluorescence).,其他研究,一、生物学特性；疫苗研究基础二、检测方法；悬浮芯片三、发病机制；免疫应答四、反向遗传：NSs功能,理化因素对SFTSV的影响,空斑形成和PRNT,重组蛋白的表达和纯化,悬浮芯片检测10种病毒IgG抗体,细胞因子的改变,从cDNA拯救感染性重组病毒,5 Plasmids