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Western Blot实验报告正式实验客户姓名： 报告日期： 一、客户样品及抗体登记1样品种属来源：2样品标记：组织细胞样品名称备注3抗体名称： 抗体来源： 抗体Cat. 及lot号：二、材料和方法1试剂及耗材蛋白抽提试剂（改进型RIPA配方）BCA蛋白定量试剂盒2mg/ml BSA标准品5还原样品缓冲液10Tris-Glycine-SDS电泳缓冲液考马斯亮蓝染色液10TBST pH8.0中分子量蛋白marker（7条带）中分子量预染蛋白marker（7条带）湿转缓冲液NC膜，0.45um孔径Millipore丽春红染色液BSAAmrescoPMSFAmresco蛋白酶抑制剂Roche磷酸酶抑制剂Roche脱脂奶粉伊利ECLMilliporeStripping buffer（抗体洗脱液）（抗体需要选择，选择后把多余的删除）山羊抗兔IgG（H+L），HRPJackson山羊抗小鼠IgG（H+L），HRPJackson兔抗山羊IgG（H+L），HRPJacksonBeta-actin 兔多抗Beta-actin 鼠单抗Beta-tubulin 兔多抗Beta-tubulin鼠单抗GAPDH 兔多抗GAPDH 鼠单抗2实验仪器Fresco低温冷冻离心机ThermoMultiSkan3酶标仪ThermoMini P-4电泳槽Cavoy湿转电泳槽Cavoy电泳仪Bio-Rad半干槽Bio-Rad水平脱色摇床其林贝尔酸度计 pH211Hanna电动组织匀浆器Fluka三、 实验方法及结果3.1 蛋白抽提3.1.1组织蛋白抽提预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂）。在蛋白抽提开始前加入0.1M PMSF母液，PMSF终浓度1mM。称取组织重量以重量：裂解液体积=1:9比例加入裂解液，用眼科剪剪碎组织块，Fluka电动组织匀浆器15000rpm转速进行匀浆，每次10s，间隔10s，进行三次匀浆。匀浆时EP管需要浸入冰水混合物中进行降温。匀浆完成后在冰上孵育20min，4度离心，13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装保存，待测。3.1.2细胞蛋白抽提预冷RIPA蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂（磷酸化蛋白需要同时加入磷酸酶抑制剂）。在蛋白抽提开始前加入0.1M PMSF母液，PMSF终浓度1mM。细胞计数，以细胞数量1107加入1ml裂解液，用枪头吹打充分悬起细胞，完成后在冰上孵育20min，4度离心，13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装保存，待测。3.2 BCA法蛋白定量准备BCA工作液 A液：B液=50:1，稀释好各个提取BSA标准品。样品用PBS进行稀释。样品：BCA工作液=1:8，混匀后37度孵育30min或者室温孵育60min，酶标仪570nm波长滤光片读取OD值。蛋白浓度计算见下表：3.3 蛋白浓度调整以RIPA调整蛋白浓度，加入5还原样品缓冲液后样品终浓度为2-4mg/ml（不同样品具体确定）。煮沸变性5min。样品蛋白浓度调整见下表：3.4 SDS-PAGE3.4.1 根据目的蛋白的分子量，配制12%分离胶，浓缩胶浓度为5%。3.4.2 待检测蛋白样品上样量：上样20ug3.4.3 电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min，溴酚蓝进行分离胶界面；分离胶恒压160V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。3.4.4 用考马斯亮蓝染色液进行染色。染色结果见下图：3.5 目的蛋白WB正式实验3.5.1 根据目的蛋白的分子量，配制%分离胶，浓缩胶浓度为5%。3.5.2 待检测蛋白样品上样量：3.5.3 电泳条件：浓缩胶恒压90V，约20min；分离胶恒压160V，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。3.5.4 湿转法，转膜条件：300mA恒流；0.45um孔径NC膜，转膜时间h。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。同时做好泳道标记，准备预实验时进行按照纵向泳道剪膜。3.5.5 封闭：将膜完全浸没5%脱脂奶粉-TBST中室温轻摇60min。 3.5.6 一抗孵育：用5%脱脂奶粉-TBST稀释稀释一抗，室温孵育10min，放4过夜。膜编号一抗名称稀释比例稀释后体积备注：按照预实验中确定的稀释度进行正式实验。选择一种内参进行同步预实验。3.5.7 第二天从4度拿出膜，在室温孵育30min。洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。3.5.8 二抗孵育：用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG（H+L） HRP 山羊抗小鼠IgG（H+L） HRP，1:10000，室温轻摇 40min。洗膜：TBST洗膜6次，每次3min。3.5.9 ECL加到膜上后反应3-5min，胶片曝光：10s-5min（曝光时间随不同光强度而调整），显影2min，定影。胶片扫描后结果如下：3.6 内参蛋白WB正式实验3.6.1 Stripping Buffer洗膜，37洗膜30min（如果目的蛋白与内参蛋白分子量相差在10K以上，可以不用stripping buffer洗膜这一步）。3.6.2 洗膜：去离子水洗膜3次。3.6.3 洗膜：TBST洗膜3次，每次3min3.6.4 将膜完全浸没3%BSA-TBST中室温轻摇30min。3.6.5 孵育内参：加Beta-actin兔多抗，用5%脱脂奶粉-TBST稀释抗体，1：3000稀释，室温孵育2h。3.6.6 洗膜：TBST洗膜5次，每次3min。3.6.7 二抗孵育：用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗，山羊抗兔IgG（H+L） HRP 山羊抗小鼠IgG（H+L） HRP，1:10000，室温轻摇 40min。洗膜：TBST洗膜6次，每次3min。3.6.8 洗膜：TBST洗膜5次，每次3m