多糖结构分析

1 6 多糖结构研究方法 多糖及其复合物是来自于高等动 植物细胞膜和微生物细胞壁中的天然大 分子物质之一 自然界含量丰富 与人类生活紧密相关 对维持生命活动起至 关重要的作用 多糖和核酸 蛋白质 脂类构成了最基本的 4 类生命物质 由 于多糖的生物活性与多糖的结构关系密切 因此清楚认识多糖的结构是进行多 糖研究和利用的基础 多糖结构比蛋白质和核酸的结构更加复杂 可以说是自 然界中最复杂的生物大分子 从化学观点来看 多糖结构解析最大的难点就在 于其结构的复杂性 糖的结构分类可沿用蛋白质和核酸的分类方法 即多糖的 结构也可分为一级 二级 三级和四级结构 与蛋白质或核酸大分子相比 糖 链的一级结构 含义 要十分丰富 测定糖链的一级结构 要解决以下几个问 题 1 相对分子质量 2 糖链的糖基组成 各种单糖组成的摩尔比 3 有无糖 醛酸及具体的糖醛酸类型和比例 4 各单糖残基的 D 或 L 构型 毗喃环或呋 喃环形式 5 各个单糖残基之间的连接顺序 6 每个糖苷键所取的 a 或 B 异 头异构形式 7 每个糖残基上羟基被取代情况 8 糖链和非糖部分连接情况 9 主链和支链连接位点 10 糖残基可能连接硫酸酯基 乙酰基 磷酸基 甲 基的类型等 多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有 规则的构象 与分子主链的构象有关 不涉及侧链的空间排布 多糖的三级结 构和四级结构是指以二级结构为基础 由于糖单位之间的非共价相互作用 导 致二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象四 多糖结构的分析手段很多 不仅有仪器分析法 如红外 核磁共振 质谱等 还有化学方法 如完全酸水 解 部分酸水解 高碘酸氧化 Smith 降解 甲基化反应等 以及生物学方法 如特异性糖苷酶酶切 免疫学方法等 1 质谱 MS 由于 MS 法在糖链结构分析中具有快速灵敏 样品用量少 结构信息直观 的特点而得到越来越广泛的应用 近年来各种软电离技术的诞生 如快原子轰 击质谱 FAB MS 电喷雾质谱 ESI MS 基质辅助激光解析离子化质谱 MALDI MS 等 使得糖结构分析的研究取得了日新月异的发展 1 快原子轰击质谱 FAB MS FAB MS 是上世纪 80 年代初发展起来的一种新的软电离质谱技术 其显著 区别于传统质谱之处在于样品受加速原子或离子的轰击 可直接在基质溶液中 电离 FAB MS 的引入使传统质谱技术难以分析的极性强 难挥发以及热不稳 定的化合物不经衍生化就可以直接进行质谱分析 而且对生物大分子的研究取 得了重大突破 FAB MS 已被证明是分析糖结构最为有力的方法之一 它不仅 可以测定寡糖及其衍生物的分子量 而且可以测定聚合度高于 30 的糖的分子量 同时 FAB MS 还可以确定糖链中糖残基的连接位点和序列 已广泛用于糖类 的分析 2 电喷雾质谱 ESI MS ESI MS 是将溶液中分子转变成气相离子非常有效的手段 是目前最软的一 2 6 种电离方式 这种电离方式所产生的分子离子往往带有多电荷 因此 ESI MS 可以测定的分子量范围大大扩展 对多糖而言 ESI MS 可以分析 nh25 个甚至 更多单糖残基组成的含有羧基或硫酸根等官能团的多糖 近年来 ESI MS 已在 多糖的结构分析中显示了强大的生命力 它能用于衍生化和非衍生化多糖的测 定 ESI MS 易与 HPLC CE 等技术联用 大大提高了工作效率以及灵敏度和 精确度 如 ESI MS 与 I IPLC 联用分析寡糖及其衍生物 3 基质辅助激光解析离子化质谱 MALDI MS MALDI MS 于上世纪 80 年代末问世 由于技术的特点 这种离子化方式 电离出的离子常用飞行时间 TOF 检测器检测 因此 MALDI MS 常与 TOF 一起 称为基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱 MALDI TOF MS 它也是一种软 电离方式 产生的分子离子十分稳定 不易裂解 所以适用于检测大分子质量 的生物样品 2 红外光谱 IR 红外光谱 infrared spectroscopy IR 是一种吸收光谱 因为红外光只能激发 分子内原子核之间的振动和转动能级的跃迁 所以红外吸收光谱是通过测定振 动和转动能级跃迁的信息来研究分子结构的 在红外光谱图中 纵坐标一般用 线性透光率作标度 称为透射光谱图 也有采用非线性吸光度为标度的 称为 吸收光谱图 谱图中的横坐标是以红外辐射光的波数 锄 d 为标度 较少采用波 长 pm 为标度 波长和波数的关系依照式为 v cml u 岬 104 红外辐射光 的波数可分为近红外区 10000 4000cm 1 中红外区 4000 400cm 1 和远红外区 400 10 cnl 1 其中最常用的是中红外区 大多数化合物的化学键振动能级的跃 迁发生在这一区域 因此主要研究中红外区域的吸收光谱即分子的振动光谱 可以对各种高分子材料进行分析 测定 则对应这些基团的一些谱带在这个化 合物的取光谱中往往是最强的 明显地显示这个基团的结构特征 因此 对应 这些基团的谱带在其聚合物的谱图中 常常是处于最显著的地位 能够很特征 地反映该类聚合物的结构和预示其存在 对于各种聚合物分子来说 含有的主 要极性基团是酸 酯 酰胺 酰亚胺 苯醚 脂肪醚和醇等 除此之外 含有 硅 硫 磷 氯和氟等杂原子的化合物也常具有较强的极性 红外光谱作为 分子的指纹 广泛用于分子结构和物质化学组成的研究 根据分子对红外光 吸收后得到谱带频率的位置 强度 形状以及吸收谱带和温度 聚集状态等的 关系便可确定分子的空间构型 求出化学键的力常数 键长和键角 从光谱分 析的角度看主要是利用特征吸收谱带的频率推断分子中存在某一基团或键 由 特征吸收谱带频率的变化推测临近的基团或键 进而确定分子的化学结构 当 然也可由特征吸收谱带强度的改变对混合物及化合物进行定量分析 3 拉曼光谱 拉曼散射又称拉曼效应 是由印度物理学家拉曼于 1928 年首先发现并因此 获得 1930 年诺贝尔物 理奖 拉曼效应是能量为 hvo 的光子同分子碰撞所产生 的光散射效应 也就是说 拉曼光谱是一种散射光谱 单色光束的入射光光子 3 6 与分子相互作用时可发生弹性碰撞和非弹性碰撞 在非弹性碰撞过程中 光子 与分子之间发生能量交换 光子不仅仅改变运动方向 同时光子的一部分能量 传递给分子 或者分子的振动和转动能量传递给光子 从而改变了光子的频率 简单来说 散射分子的转动能级和振动能级发生了变化是产生拉曼散射的原因 此时散射光子频率不同于入射光子 因此 每种物质的拉曼光谱也就是拉曼散 射光谱都只与其自身的分子结构有关 而与入射光的频率无关 拉曼效应普遍 存在于一切分子中 无论是气态 液态和固态 拉曼散射光谱对于样品制备没 有特殊要求 对于样品数量要求比较少 拉曼散射最突出的优点是采用光子探 针 对于样品无损伤探测 尤其适合对稀有或珍贵的样品进行分析 甚至可以 用拉曼光谱检测活体中的生物物质 拉曼光谱与红外光谱是相互补充的 在各 种分子振动方式中 强力吸收红外光的振动能产生高强度的红外吸收峰 但只 能产生强度较弱的拉曼谱峰 反之 能产生强的拉曼谱峰的分子振动却产生较 弱的红外吸收峰 将两者结合起来才能得到分子振动光谱的完整数据 更好地 解决分子结构的分析问题 常用的拉曼光谱技术主要有 显微共焦拉曼光谱技 术 傅里叶变换拉曼光谱技术 共振增强拉曼光谱技术和表面增强拉曼光谱技 术 1 显微共焦拉曼光谱技术 显微共焦拉曼光谱技术是将拉曼光谱分析技术与显微分析技术结合起来的 一种应用技术 通过两根光导纤维将显微镜与拉曼光谱仪组合起来 实验时通 过显微镜观察 选择有关分析所感兴趣的待测样品的部位 一根光导纤维将被 激发的激光光束从光谱仪传递到显微镜待测样品部位 入射激光通过显微镜聚 焦后 照射到被测样品上 另一根光导纤维将拉曼散射光辐射传递回光谱仪的 有关部位 传递回来的拉曼散射光信号被相干仪所调整 形成光谱信号 显微 共焦拉曼光谱技术可在不受周围成分干扰的情况下 精确获取微区内的化学信 息 如化学成分 晶体结构 分子取向及分子间相互作用等 2 傅里叶变换拉曼光谱技术 傅里叶变换拉曼光谱一般采用波长 1064nm 的近红外激光作为激发光源 分子的荧光不被激发 避免了许多样品拉曼光谱中的荧光干扰 近 90 的化合 物可获得拉曼光谱 3 共振增强拉曼光谱技术 当激发光的频率接近或等于被测分子的电子吸收频率 紫外 可见光 时 某一条或几条特定的拉曼线强度会急剧增加 甚至可以出现正常拉曼效应中观 察不到的泛频及组合振动频率的谱峰 共振拉曼光谱灵敏度高 可检测低浓度 和微量样品 可研究大分子聚集体的局部结构 已成为研究有机分子 离子 生物大分子甚至活体组织的有利工具 4 表面增强拉曼光谱技术 表面增强拉曼光谱技术是一种新的表面测试技术 它可以在分子水平上研 究材料分子的结构信息 具有极高的灵敏度和选择性等独特的优点 4 6 4 X 射线衍射 XRD 1912 年德国物理学家劳厄 Laue 等人根据理论预见 并用实验证实了 X 射 线具有波动性 它与晶体相遇时能产生衍射现象 并证明了 X 射线的波动性和 晶体内部结构的周期性 开创了 x 射线晶体学这一新领域 当一束单色 x 射线 入射到晶体时 由于这些规则排列的原子间距离与入射 X 射线波长有相同数量 级 故能相互干涉 在某些特殊方向上产生 X 射线衍射 衍射线在空间分布的 方位和强度 与晶体结构相关 衍射线空问方位与晶体结构的关系可用布拉格 Bragg 方程表示 2dsin n 式中 d 为晶面间距 为掠射角 n 为反射级数 为 x 射线波长 5 核磁共振 NMR 核磁基振 缩写为 NMR 是指核磁矩不为零的核 在外磁场的作用振能提 供有关化学结构及分子动力学的信息 成为分子结构解析的一个有力工具 核 磁共振技术于 1946 年美国哈佛大学的波赛尔和斯坦福大学的布洛赫发现的 经 过 60 多年的理论和技术上的发展 取得了非常惊人的成就 该领域已先后有 6 位科学家获得 4 次诺贝尔奖 现在核磁共振技术己经广泛应用于物理 化学 医学 生物等多个领域 尤其是现在用多核 多维核磁共振方法进行的生物大 分子 蛋白质 核酸等 的三维空间构象和动力学研究更加引人注目 近些年来 人们通过核磁共振或 X 射线晶体衍射技术解析了越来越多的蛋白质及其复合物 的结构 通过对这些结构的分析 人们对生物大分子架构 酶作用的活性位点 蛋白质与蛋白质相互作用的界面等有了更深入的了解 但是 随着了解的加深 人们同时认识到仅仅对静态结构的了解并不足以解释蛋白质在生理过程中的作 用机理 因为三维空间的结构仅仅是基态的结构 而在生理过程中蛋白质分子 更多的处于激发态 并同蛋白质分子的运动特性密切相关 我们必须了解蛋白 质分子结构随时间的变化 从而在分子的静态结构和动态结构间架起一座桥梁 这样才能最终揭示蛋白质分子结构与功能的关系 6 扫描电子显微镜 扫描电子显微镜简称为扫描电镜 英文缩写为 SEM ScanningElectron Microscope SEM 与电子探针 EPMA 的功能和结构基本相同 但 SEM 一般不 带波谱仪 WDS 它是用细聚焦的电子束轰击样品表面 通过电子与样品相互 作用产生的二次电子 背散射电子等对样品表面或断口形貌进行观察和分析 现在 SEM 都与能谱 EDS 组合 可以进行成分分析 所以 SEM 也是显微结构 分析的主要仪器 已广泛用于材料 冶金 矿物 生物学等领域 扫描电镜主 要包括电子光学系统 扫描系统 信号检测放大系统 图象显示和记录系统 电源 和真空系统等 其工作原理 图 1 1 在高电压作用下 从电子枪射出来 的电子束往聚光镜和物镜聚焦成很细的高能电子束 在扫描线圈的作用下 在 试样的表面进行帧扫描 电子束与试样表面物质相互作用产生背散射电子 二 次电子等各种信息 探测器将这些信号接受 经放大器放大去调节显像管的栅 5 6 极 并在荧光屏上显示出衬度 扫描电镜的主要性能与特点 放大倍率高 从几十放大到几十万倍 连续 可调 分辨率高 景深大 景深大 图像立体感强 样品通常不需要作任何处 理即可以直接进行观察 所以不会由于制样原因而产生假象 这对断口的失效 分析特别重要 样品制备简单 可以是自然面 断口 块状 粉体 反光及透 光光片 对不导电的样品只需蒸镀一层 20nm 的导电膜 另外 现在许多 SEM 具有图像处理和图像分析功能 有的 SEM 加入附件后 能进行加热 冷却 拉 伸及弯曲等动态过程的观察 但扫描电镜只能观察物质表面的微观形貌 无法 获得物质内部的信息 7 透射电子显微镜 透射电子显微镜是以波长很短的电子束做照明源 用电磁透镜聚焦成像的 一种具有高分辨本领 高放大倍数的电子光学仪器 测试的样品要求厚度极薄 几十纳米 以便使电子束透过样品 在真空条件下 电子束经高压加速后 穿透样品时形成散射电子和透射电子 它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成 像 投射电子显微镜结构如图 1 2 所示 91 透射电子显微术在高分子研究中 有着重要的应用 它可用来观察高分子晶体的形貌和结晶结构 高分子多相体 系的微观相分离结构 高分子材料的网络 测定高分子的分子量分布和多孔高 分子薄膜的微孔大小与分布 高分子材料的表面 界面和断口 粘合剂的粘结 效果以及聚合物涂料的成膜特性 还可用来使高分子晶体的晶格至高分子本身 直接成像 透射电镜由于入射电子透射试样后 将与试样内部原子发生相互作 用 从而改变其能量及运动方向 显然 不同结构有不同的相互作用 这样 就可以根据透射电子图象所获得的信息来了解试样内部的结构 由于试样结构 和相互作用的复杂性 因此所获得的图象也很复杂 它不象表面形貌那样直观 易懂 8 差示扫描量热法 DSC DSC 是在程序控制温度条件下 测量输入给样品与参比物的功率差与温度 关系的一种热分析方法 差示扫描量热法又称为差动分析 有功率补偿式差示 扫描量热法和热流式差示扫描量热法