1材料与方法范文

1 1材料与方法范文材料与方法范文 分类号学校代码11460学号08411539南京晓庄学院本科生毕业论文植 物表达载体pCAMBIA1301 NoHYG rd29A CBF3的构建与鉴定Constructing andIdentifying thePlant ExpressionVector pCAMBIA1301 NoHYG rd29A CBF3所在院 系 生物化工与环境工程学院学生姓名张唯指导教师蔡 小宁研究起止日期二 一一年十一月至二 一二年五月二 一二年 五月学位论文独创性声明本人郑重声明1 坚持以 求实 创新 的 科学精神从事研究工作 2 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果 3 本论文中除引文外 所有实验 数据和有关材料均是真实的 4 本论文中除引文和致谢的内容外 不包含其他人或其它机构已经 发表或撰写过的研究成果 5 其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢 意 作者签名日期南京晓庄学院xx届本科毕业论文1植物表达载体pCAMBI A1301 NoHYG rd29A CBF3的构建与鉴定作者张唯指导老师蔡小宁摘要 克隆和分析拟南芥 逆境诱导型启动子rd29A 冷诱导转录因子CBF3 将有助于更好地研 究植物的耐盐 抗寒和抗旱机理 本研究采用常规分子克隆技术 剔除双元植物表达载体pCAMBIA1301 中的潮霉素筛选标记基因 用rd29A启动子替换pCAMBIA1301 NoHYG载体上的35S启动子 并结合基因CBF3序列构建新的植物表达 载体pCAMBIA1301 NoHYG rd29A CBF3 关键词拟南芥 CBF3 rd29A 潮霉素 载体构建Constructing andIdentifying thePlant ExpressionVector pCAMBIA1301 NoHYG rd29A CBF3Author Zhang WeiSupervisor Cai XiaoningAbstract Cloning andanalysising thestress inducedpromoter rd29A cold inducedtranscription factorCBF3of Arabidopsis thaliana willhelp betterresearch saltresistance cold resistanceand droughtresistance mechanismin theplant Using themon molecularcloning technology eliminating geneselection markerof hygromycinin dualplant expressionvector PCAMBIA1301 Using rd29A promoterto replace35S promoterin thepCAMBIA1301 NoHYG carriers and binewith geneCBF3to constructthe newplant expressionvector pCAMBIA1301 NoHYG rd29A CBF3 启动子是结构基因5 端上游与RNA聚合酶及一些反式作用因子结合的 区域 是供RNA聚合酶识别 结合并确保转录精确而有效地起始的一 段DNA序列 其结构直接关系到转录的效率 因此启动子中会含有一些决定基因表达效率和特异性的元件 研究表明 诱导型启动子能控制基因在特定时期 特定部位的表达 这既避免了目的基因在寄主细胞内组成型高表达对寄主细胞生长 的影响 又可使寄主细胞对诸如热激 光照 创伤等特定的环境信 号做出反应 2 最近 人们研究发现了许多逆境胁迫诱导表达基因 并从模式植物 拟南芥中鉴定克隆出9个独立的干旱胁迫诱导表达基因Rd Responsiv e toDehydration 3 其中 rd29A基因的表达受干旱 高盐 低温等逆境的胁迫诱导 在转基因植物研究中 应用最广泛的组成型启动子是花椰菜花叶病 毒 CaMV 35S启动子 但其在应用过程中 暴露出一些问题 降低了 转化效率 在各种启动子的研究过程中 有人做了一次比较实验分别将CaMV35S 启动子和一个与逆境胁迫应答有关的转录因子DREB dehydration responsive elementbinding protein 基因 rd29A启动子和DREB转录因子基因串联克隆到一个表 达载体并转化拟南芥 发现两种启动子调控的DREB转录因子基因的 表达都使转基因植物对干旱 高盐 低温等逆境具有抗性 但组成型启动子CaMV35S在正常生长条件下也调控转录因子DREB基因 的超表达 从而使转基因植物在正常生长条件下出现生长受阻现象 而诱导型启动子rd29A在正常条件下不调控转录因子DREB基因的超 表达 从而使转基因植物在正常条件下不出现上述生长受阻现象 4 这一结果说明 使用诱导型启动子rd29A来调控一些逆境胁迫诱导基 因的表达 可以使转基因植物在逆境中具有高度抗性 而在正常条 件下生长良好 这种启动子已成为目前转基因植物领域的一个研究热点 近来 诱导型rd29A启动子不仅应用于拟南芥 烟草中 5 还有研 究者已应用rd29A启动子连接GUS报告基因 导入水稻 在逆境胁迫 条件下 也观察到转基因水稻植株中的GUS活性 6 Yamaguchi shinozaki和shinozaki 7 以拟南芥为研究对象 从rd29A基因的启 动子中鉴定出一个9bp TACCGACAT 的DNA调控元件DRE dehydration responsive element 同年 从cor15a基因的启动子中又鉴定出另一调控元件CRT C repeat TGGCCGAC 8 这两个元件均含有CCGAC核心序列 即通称为DRE CRT元件 CRT DRE是高等植物中抗寒 抗旱基因的一种顺式作用因子 位于COR cold regulated 基因的启动子区域 1997年 stocking等 9 首次从拟南芥中分离鉴定出一种编码转录因 子的cDNA 这种转录因子能识别COR基因中的CRT DRE元件并与之结 合 故命名为南京晓庄学院xx届本科毕业论文4CBF1 CRT DRE bindingfactor1 即CRT DRE结合因子 将CBF1基因转入野生型的拟南芥中 能诱导冷诱导基因在常温下表 达 增强了拟南芥的抗寒能力 后来人们发现拟南芥CBF1基因属于一个包括CBF 1 CBF 2 CBF 3 CBF 4 CBF5和CBF6基因在内CBF基因家族 该基因家族成员均具有提高 植物抗寒性的功能 CBF3在拟南芥生长发育中起着重要的作用 CBF3不局限于冷诱导 盐胁迫 干旱胁迫诱导 但该基因如何感受上游诱导信号从而激发 下游抗寒 耐盐和抗旱相关基因表达的传导机制还不十分清楚 标记基因是帮助转基因生物工程体进行筛选和鉴定的一类外源基因 包括选择标记基因和报告基因 在基因工程中 标记基因的出现使筛选转基因阳性植株获得了很大 的方便 是筛选和鉴定转化的细胞 组织和转基因植株的有效方法 然而标记基因不利于细胞的多重转化 在第一次转化中使用了某一 标记基因 在随后的转化中就要使用不同的标记基因 目前转基因中所应用的转化系统 只能使一小部分细胞稳定转化 人们希望导入更多的优良性状基因 而不是标记基因 因此在多重 转化中应考虑将标记基因进行消除 10 另外 人们发现 剔除转基因植物中的标记基因 不但在转化后和 商品化之前能够允许再次使用相同的标记基因转化同一植株 而且 由重复的启动子 终止信号序列 或者编码区所引起的基因沉默 和基因重排等现象也可以被避免 有助于进行多种优良性状的组合 因此 剔除标记基因已成为目前转基因植物领域的又一个研究热点 综上所述 本实验以模式植物拟南芥为主要实验材料 运用常规分 子实验技术 进行了拟南芥逆境诱导型启动子rd29A驱动表达的转录 因子CBF3基因的载体的构建 并对pCAMBIA1301双元植物表达载体进 行了潮霉素筛选标记基因的剔除 以便进一步进行农杆菌侵染烟草 实验 得到具有目的基因和抗逆性的植株 为以后耐盐相关基因和 逆境诱导表达的研究分析奠定基础 1 材料与方法1 1实验材料1 1 1供试材料pCAMBIA1301载体与DH5 大肠杆菌由江苏省农业科学院提供 pCAMBIA1301 rd29A CBF3载体由本实验室提供 已保存于 20 冰箱 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成 Taq DNA聚合酶 2 5mmol L dNTPs 10 PCR Buffer Mg2 free 25mmol L MgCl 2 无菌双蒸水ddH2O 琼脂糖 溴化乙锭 EB 1 TAE电泳缓冲 液等购自南京天为生物科技有限公司 1 1 2引物设计南京晓庄学院xx届本科毕业论文5根据GenBank上公布 的pCAMBIA1301的序列 登录号为AF234297 1 拟南芥rd29A基因 家族序列 登录号为AF076155 与拟南芥CBF3基因的序列 登录号 为AF234297 1 设计四对引物 引物序列见表1 由南京金斯瑞生物 科技有限公司合成 表1扩增目的片段的引物序列目的片段引物序列rd29A29A 5a 5 TCTAGATGATGCCTCTGTTTGTGAATTTGATG 3 29A 3a 5 CCATGGATATTTGTGAGTAAAACAGAGGAGGGTC 3 CBF3F3 5 5 CCATGGATTTCAGCAAACCATACC 3 F3 3 5 GGTCACCTTTAATAACTCCATAACG 3 1301m1301m 55 GCTTAGTTGCCGTTCTTCC 3 1301m 35 TAGCATTCGCCATTCAGG 3 HYG Hyg 5 5 AGCTGCGCCGATGGTTTCTAC 3 Hyg 3 5 ATCGCCTCGCTCCAGTCAATG 3 引物29A 5a的5 端加XbaI酶切位点 29A 3a的5 端加NcoI酶切位点 引物F3 5的5 端加NcoI酶切位点 F3 3的5 端加BstEII酶切位点 引物HYG 5的5 端加EcoRI酶切位点 HYG 3的5 端加XhoI酶切位点 1 1 3培养基LB 大肠杆菌 培养基 1L 胰蛋白胨10g L酵母膏5g L氯化钠 NaCl 10g L琼脂15g L 液体培养基不加 卡那霉素50mg L YEB 农杆菌 培养基 1L 牛肉膏5g L酵母膏1g L胰蛋白胨5g L蔗 糖5g L MgSO4 7H2O4g L琼脂15g L 液体培养基不加 南京晓庄学院xx届 本科毕业论文6高压灭菌锅灭菌 然后倒入平板 1 1 4主要试剂盒TaKaRa DNABlunting Kit DNA平滑化连接试剂盒 TaKaRa TaqTM酶 TaKaRa MiniBESTPlasmid Purification Kit Ver 2 0 质粒提取试剂盒 和TaKaRa AgaroseGel DNAPurificationKitVer 2 0 琼脂糖胶回收提纯DNA试剂盒 购自T aKaRa生物工程 大连 有限公司 Restriction Endonuclease 限制性内切酶 与T4DNA Ligase T4DNA连接酶 购自NEB 北京 生物科技有限公司 1 1 5主要仪器设备MJ PCR扩增仪 Eppendorf移液枪 Eeppendorf超速冷冻离心机 DYY 8C型电泳仪 凝胶成像系统 恒温摇床 恒温培养箱 恒温干燥箱 低温冰箱 超低温冰箱 超净工作台 高压灭菌锅 SP 2102UV型微量紫外分光光度计 LQP B 4颗粒测定仪 制冰机 等 1 1 6溶液配制卡那霉素 Kana 液 50mg mL 50mg Kana溶于l mL蒸馏水中 20 保存 50 xTAE Tris242g 冰醋酸57 1mL 0 5M EDTA pH8 0 100mL 加水定容至1 升 1 2实验方法1 2 1pCAMBIA1301 NOHYG质粒载体的构建1 2 1 1pCAMBIA1301质粒载体酶切反应分别用 EcoRI和XhoI限制性内切酶双酶切pCAMBIA1301纯化质粒 酶切体系 如下 总体积20 L 10 xbuffer IV2 L DNA纯化质粒7 L100 x BSA0 2 L EcoRI 11037 0 5 L XhoI 8913 0 5 L ddH2O9 8 L37 温育酶切5小时 65 20min失活 用1 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 用琼脂糖胶回收提纯DNA试剂盒 回收大于2000bp的目的片段 1 2 1 2pCAMBIA1301质粒载体酶切后片段的末端平滑反应体系1 在 微量离心管中制备下列反应液 总体积9 L DNA片段 粘性端 6 L南京晓庄学院xx届本科毕业论文710 xbuffer1 L ddH2O2 L2 70 保温5min 然后转移至37 保温 3 加入1 L的T4DNA Polymerase T4DNA聚合酶 轻柔混匀 不可剧烈振荡 4 37 反应5min 5 激烈振荡 使T4DNA Polymerase失活 然后置于冰上 准备进行下一步反应 6 此时酶切后的粘性末端已经平滑化 接下来进行线性平滑末端DN A的自身环化平滑化反应 由上步反应获得的10 L的产物 加入4倍 体积 40 L 的Ligation SolutionA 均匀混合 加入1倍体积 10 L 的Ligation SolutionB 均匀混合 16 反应30min 反应之后即得到平滑化后两端重新连接成新的去除潮霉素抗性基 因的pCAMBIA1301环状质粒载体 然后将上述的反应液 20 L以下 加入至100 L的DH5 大肠杆菌感 受态细胞进行转化 通过将转化细胞的涂布和筛选后 用TaKaRa质粒提取试剂盒对菌液 进行质粒提取 再进行PCR检测 即为构建的去除潮霉素抗性基因的 pCAMBIA1301环状质粒载体 1 2 2pCAMBIA1301 NOHYG RD29A表达载体的构建1 2 2 1载体与目的基因的双酶切和连接双酶 切质粒pCAMBIA1301 NoHYG 35S 上一步已完成 与pCAMBIA1301 rd29A CBF3 限制性内切酶分别为XbaI和NcoI 用1 琼脂糖凝胶电泳检测P CR产物 用琼脂糖胶回收提纯DNA试剂盒回收pCAMBIA1301 NoHYG 35S中的大片段和pCAMBIA1301 rd29A CBF3中的rd29A片段 连接体系目的基因3 L载体1 L T4DNA连接酶1 L Buffer5 L ddH2O补足10 L体系 16 过夜1 2 2 2用CaCl2制备大肠杆菌感受态 细胞1 挑取大肠杆菌单菌落 接种于20ml LB培养基中 37 摇菌过夜 2 吸取200 L菌液 接种于50mL LB培养基中摇菌2h左右 经常观察菌液的生长状况 至OD约为0 4左 右 3 将菌液倒入一个10mL的无菌离心管中 置于冰上冷却10min 南京晓庄学院xx届本科毕业论文84 4 4000rpm离心10min 5 倒出培养液 将管倒置1min 加入3mL冰预冷的0 1M的CaCl2轻轻 地重悬菌体 冰上放置30min 6 4 4000rpm离心10min 7 小 心倒掉上清 加入600 L冰预冷的0 1M的CaCl2 轻轻的重悬 8 用 1 5mL的无菌EP管分装成200 L 管 加入1 4体积的无菌甘油 液氮 冷萃 放入 70 保存备用 1 2 2 3大肠杆菌转化1 取一管感受态 1 2 2 2用CaCl2制备大肠杆 菌感受态细胞 细胞分别加入上次实验的所有连接产物 10 L 轻轻混匀 冰上放置30min 2 42 热激90s 3 迅速冰上放置3 5min 4 在上述各管中加入800 L LB培养液混匀 37 100rpm摇菌1h 使已转化的细胞繁殖1 2代 涂布于含KANA的LB平板上 1 2 2 4阳性克隆筛选及转化子的 扩增和鉴定1 选取LB培养基上的合适的菌落 用接种环划线于另一 含KANA的培养基上 此时采用分区划折线的方法 2 将接种好的培 养基 37 倒置平板培养12 19h 3 在含折线的培养基上选取单菌落 继续用接种环划线于另一 KANA的培养基上 此时采用画斜线的方法 4 将接种好的培养基 37 倒置平板培养12 19h 待菌生长繁殖数代后 进行PCR检测 5 PCR检测反应体系引物各1u l MIX6 75ul DNA1ul ddH2O 4 25ul PCR检测反应程序29A 3a和29A 5a为引物进行PCR扩增 程序为94 预变性5min 94 变性30s 52 退火40s 72 延伸2min 30个循环 72 延伸10min 1301m 3和1301m 5为引物进行PCR扩增 程序为94 预变性5min 94 50s 49 40s 72 1min 30个循环 72 延伸10min 南京晓庄学院xx届本科毕业论文91 2 3pCAMBIA1301 NOHYG rd29A CBF3表达载体的构建1 2 3 1载体与目的基因的双酶切和连接双酶切 质粒pCAMBIA1301 NoHYG rd29A 上一步以完成 与pCAMBIA1301 rd29A CBF3 限制性内切酶分别为BstEII和NcoI 用1 琼脂糖凝胶电泳检 测PCR产物 用琼脂糖胶回收提纯DNA试剂盒回收 1301 NoHYG rd29A的大片段和pCAMBIA1301 rd29A CBF3的CBF3片段 酶切体系与连接体系见1 2 2 1 1 2 3 2用CaCl2制备大肠杆菌感受 态细胞见1 2 2 21 2 3 3大肠杆菌转化见1 2 2 31 2 3 4阳性克隆 筛选及转化子的扩增和鉴定见1 2 2 4F3 3和F3 5为引物进行PCR扩增 程序为94 预变性5min 94 50s 47 40s 72 1 5min 30个循环 72 延伸10min 2 结果与分析2 1pCAMBIA1301剔除潮霉素抗性基因的载体构建为构 建pCAMBIA1301剔除潮霉素抗性基因 包括上游启动子 的载体 需 要通过以下几个步骤以获得预期效果第一 用限制性内切酶EcoRI和 XhoI酶切质粒pCAMBIA1301 来获得去除潮霉素基因的pCAMBIA1301 NoHYG大片段 完全酶切 则预期获得大小在2000bp以上的不含潮霉素基因的pCAMB IA1301大片段和大小在2000bp以下的含潮霉素基因的小片段 酶切后 通过琼脂糖凝胶电泳检测 得到图1 由图1可看出 电泳后得到一条大于2000bp的大片段和一条小于2000 bp的小片段 回收不含潮霉素基因序列的pCAMBIA1301的酶切大片段 待用 南京晓庄学院xx届本科毕业论文10图1EcoRI与XhoI双酶切电泳鉴定 左侧为Marker DL2000 右侧为pCAMBIA1301的大片段第二 将回收好的大片段进行 末端平滑化反应连接 来获得剔除潮霉素抗性基因的载体 连接完成后 转化大肠杆菌 根据质粒图谱设计两组引物 一组用来检测潮霉素 HYG 基因的引 物被命名为hyg 3和hyg 5 后面简称引物HYG 另一组引物扩增区域覆盖潮霉素基因及其 下游启动子的序列 被命名为1301m 3和1301m 5 后面简称引物1301m 用引物HYG和引物1301m对未剔除潮霉素的质粒和已剔除潮霉素的质 粒进行PCR检测比较 来验证是否剔除潮霉素基因序列和载体环化连 接成功 对于未剔除潮霉素的质粒来说 用引物HYG扩增预期可得到大小为10 84bp的片段 用引物1301m扩增预期可得到大小为2777bp的片段 对于已剔除潮霉素的质粒来说 由于已剔除潮霉素 故用引物HYG扩 增检测不到片段 而用引物1301m扩增检测 仅能扩增到潮霉素基因 下游启动子序列 预期得到的片段大小为610bp 对已经转化的大肠杆菌单菌落进行PCR检测 图2为以未去除HYG的pCAMBIA1301为模板 用引物HYG进行PCR扩增检 测 得到一条大小在1000bp左右的条带 预测由引物HYG扩增的片段 大小为1084bp 说明HYG基因序列存在于此载体中 pCAMBIA1301大片段1000bp M1图2HYG基因PCR电泳鉴定 M为Marker DL2000 1为以未去除HYG的pCAMBIA1301为模板 以Hyg 5和Hyg 3为引物的PCR扩增产物 2000bp1000bp南京晓庄学院xx届本科毕业 论文11图3是以去除潮霉素抗性基因序列前后的环状质粒为模板 分 别用引物1301m进行PCR检测 并且用引物HYG对已去除HYG基因的pCA MBIA1301进行PCR检测 结果如下 1号泳道中 由于pCAMBIA1301环状质粒的潮霉素抗性基 因序列被切除 故用引物HYG扩增检测后未出现目的条带 底部靠近 100bp出现的亮带是引物二聚体 3号泳道中 以未去除HYG基因的质粒为模版 用引物1301m进行PCR 扩增 得到一条大于2000bp的条带 说明潮霉素基因序列未剔除 2 号泳道中 以去除HYG基因序列的质粒载体为模版 用引物1301m进 行PCR扩增 得到一条大小在600bp左右的条带 说明已剔除潮霉素 HYG 基因序列 为进一步检测是否剔除HYG基因序列 再次用引物1301m基因扩增 图4 待测的预期含重组质粒载体的大肠杆菌 结果显示与图3中2号 泳道大小完全吻合 上述结果说明 从pCAMBIA1301剔除潮霉素抗性基因序列的成功 并 且环化连接和转化进入大肠杆菌成功 即已成功构建pCAMBIA1301剔 除潮霉素抗性基因序列的载体 潮霉素基因序列去除前后的质粒图谱如图5所示 M1232000bp750bp100bp图3HYG基因和1301m引物PCR电泳鉴定 M为Mar ker DL2000 1为以去除HYG的pCAMBIA1301为模板 以Hyg 5和Hyg 3引物的PCR扩增产物 2为以去除HYG的pCAMBIA1301为模板 以1301 m 5和1301m 3为引物扩增产物 3为以未去除HYG的pCAMBIA1301为模板 以1301m 5和1301m 3为引物的扩增产物 图4HYG基因PCR电泳鉴定 M为MarkerDL2000 1 2 3为以去除HYG的pCAMBIA1301为模板 1301m 5和1301m 3为引物的PCR扩增产物 以2000bp750bp500bp200bp100bp M123南京晓庄学院xx届本科毕业论文122 2pCAMBIA1301 NOHYG rd29A表达载体构建为构建pCAMBIA1301 NoHYG rd29A表达载体 需要通过以下几个步骤以获得预期效果第一 分别 用限制性内切酶XbaI和NcoI酶切质粒pCAMBIA1301 rd29A CBF3和pCAMBIA1301 NoHYG 以获取质粒pCAMBIA1301 NoHYG中的大片段 片段大小在2000bp以上 与质粒pCAMBIA1301 rd29A CBF3的rd29A启动子片段 大小为1425bp 酶切检测后得到图6 从图6中可看出中 1 2号泳道为质粒pCAMBIA1301 rd29A CBF3的酶切结果 两个泳道各得到一条大于2000bp的条带和一条140 0bp左右的条带 已知rd29A启动子片段大小为1425bp 可认为泳道 中的1400bp左右的条带为rd29A启动子片段 回收此片段待用 图6中4 5号泳道为质粒pCAMBIA1301 NoHYG的酶切结果 酶切4号泳道后得到两条大于2000bp的条带和一 条750bp的条带 由于启动子中含有不同的酶切位点 故酶切后得到 三条带 又因4号泳道第一排的条带大小与1 2号泳道第一排条带大小相似 由此可认为4号泳道第一排的条带即为大片段 故质粒pCAMBIA1301 NoHYG酶切成功 同理 可分析5号泳道的结果 回收大片段待用 图5剔除潮霉素前后的质粒图谱剔除前剔除后南京晓庄学院xx届本科 毕业论文13图6图6质粒pCAMBIA1301 rd29A CBF3与质粒pCAMBIA1301 NoHYG 35s双酶切产物 1 2为pCAMBIA1301 rd29A CBF3的双酶切产物 4 5为pCAMBIA1301 NoHYG的双酶切产物 M为Marker DL2000 自上至下的片段大小如左侧图标显示 第二 用T4DNA连接 酶进行过夜连接从pCAMBIA1301 rd29A CBF3载体切下的rd29A启动子片段和从pCAMBIA1301 NoHYG中切下的大片段 并转化DH5 大肠杆菌感受态细胞 在含有5 0mg L卡那霉素的LB培养基中筛选出阳性克隆菌体 获得克隆菌体后 根据质粒载体序列设计两组引物 进行菌落PCR检 测 然后用1 琼脂糖凝胶电泳 以判断是否重组连接成功 一组为已设计好的引物1301m 另一组是用来检测rd29A基因的引物 被命名为29a 3a和29a 5a 后面简称引物29a 引物29a扩增的片段大小预期为1425bp 由图7可看出 用引物1301m进行菌落PCR扩增检测后 得到一条约为 600bp左右的条带 2号泳道 已知引物1301m扩增的阳性对照 即 去除了HYG基因序列的质粒载体 大小为610bp 1号泳道 由于1 号和2号泳道的条带大小相似 故可判定2号泳道的条带即为去除了H YG基因序列的质粒载体的PCR产物 说明载体已经转入大肠杆菌中 2000bp1000bp750bp500bp200bp100bp大片段12M45启动子南京晓庄学 院xx届本科毕业论文14由图8可看出 用引物rd29A进行菌落PCR扩增 检测后 4 10号泳道各得到一条约为1400bp的条带 已知rd29A扩增的阳性对照 条带 3号泳道 大小为1425bp 由于4 10号泳道与3号泳道条带大小相似 说明4 10号泳道中的条带是rd29A启动子序列的扩增产物 说明rd29A启动 子已经成功替换了原先的启动子 并成功转入大肠杆菌中 综上所述 质粒pCAMBIA1301 NoHYG rd29A构建成功 M345678910图8pCAMBIA1301 NoHYG rd29A的rd29A启动子序列的PCR检测 M Marker DL2000 3为rd29A阳性对照 4 10为rd29A扩增产物 2000bp750bp200bp图7pCAMBIA1301 NoHYG rd29A的引物1301m PCR检测 M Marker DL2000 1 2分别为1301m的阳性对照及1301m的扩增产物 2000bp10 00bp750bp500bp200bp100bp M12南京晓庄学院xx届本科毕业论文15由于图7得到的PCR产物条带较 弱 为避免出现假阳性条带 又从菌液中提取了质粒DNA 酶切进行 进一步检测 完全酶切得到如图9所示的结果 2 4标记的泳道为已构建的质粒pCAMBIA1301 NoHYG rd29A rd29A和HYG标记的泳道分别为阳性对照 由4标记的泳道可 看出 得到与rd29A阳性对照片段大小一致的结果及HYG阳性对照片 段大小一致的结果 再一次肯定了pCAMBIA1301 NoHYG rd29A质粒载体构建成功 以及该重组载体确实被成功转入大肠杆菌 图91301 NoHYG rd29A质粒载体的酶切检测rd29A为阳性对照 2 4为已构建好的质 粒 HYG为阳性对照2 3pCAMBIA1301 NOHYG rd29A CBF3表达载体构建为构建pCAMBIA1301 NoHYG rd29A CBF3表达载体 需要通过以下几个步骤已获得预期效果第一 分别 用限制性内切酶BstEII和NcoI酶切质粒pCAMBIA1301 rd29A CBF3和pCAMBIA1301 NoHYG rd29A Gus 以获取pCAMBIA1301 NoHYG rd29A Gus的大片段 大小在2000bp以上 和pCAMBIA1301 rd29A CBF3的CBF3基因小片段 大小为750bp 酶切检测后得到图10 由图10可看出 1 2号泳道是酶切质粒pCAMBIA1301 rd29A CBF3的产物 两个泳道各得到一条大于2000bp和一条750bp的条带 已知CBF3的片段大小为750bp 所以 泳道中的750bp的条带可判定 为CBF3片段 故pCAMBIA1301 rd29A CBF3酶切成功 回收CBF3小片段待用 3 南京晓庄学院xx届本科毕业论文164号泳道是质粒pCAMBIA1301 NoHYG rd29A Gus的酶切产物 两个泳道各得到3条大于2000bp的片段 因为启动 子中含有不同的酶切位点 故酶切出3条带 又因 3 4号泳道的第一排条带大小与 1 2号泳道第一排条带大小接近 由此可认为 3 4号泳道第一排的条带即为大片段 因而pCAMBIA1301 NoHYG rd29A Gus酶切成功 回收大片段待用 第二 用T4DNA连接酶进行过夜连接pCAMBIA1301 NoHYG rd29A Gus的大片段和pCAMBIA1301 rd29A CBF3的CBF3基因片段 并转化DH5 大肠杆菌感受态细胞 在含有50 mg L卡那霉素的LB培养基中筛选出阳性克隆菌体 获得阳性单菌落后 根据重组质粒的预测序列设计两组引物 进行 菌落PCR检测 然后用1 琼脂糖凝胶电泳来判断是否重组成功 一组引物为已设计好的引物29a 另一组是用来检测CBF3基因的引物 被命名为F 3和F 5 后面简称CBF3 引物29a扩增的片段大小预计为1425bp 引物CBF3扩增的片段大小预 计为750bp 由图11可看出 用引物CBF3进行菌落PCR扩增检测后 1 2号泳道各得到一条约为750bp的条带 已知引物CBF3扩增的阳性 对照条带 C对泳道 大小为750bp 由于 1 2号泳道的条带大小与C对泳道条带大小相似 因而可判定 1 2泳道的条带为CBF3基因的PCR检测产物 说明12M342000bp1000b p750bp500bp200bp图10植物表达载体pCAMBIA1301 NoHYG rd29A与pCAMBIA1301 rd29A CBF3的双酶切产物 MarkerDL2000自上至下片段大小如右图标所示 1 2为pCAMBIA1301 rd29A CBF3的酶切片段 M为MarkerDL2000 3 4为pCAMBIA1301 NoHYG rd29A的酶切片段CBF3大片段南京晓庄学院xx届本科毕业论文17其已 成功连入质粒pCAMBIA1301 NoHYG rd29A CBF3中 并成功转入大肠杆菌中 用引物29a进行菌落PCR扩增检测 后 3 4号泳道各得到一条大小约为1400bp左右的片段 已知引物29a扩 增的阳性对照条带 R对泳道 为1425bp 由于 3 4号泳道条带大小与R对泳道条带大小一致 因而说明 3 4号泳道的条带为rd29A启动子的PCR检测产物 且成功连入质粒p CAMBIA 1301 NoHYG rd29A CBF3中 并已成功转入大肠杆菌中 综上所述 植物表达载体pCAMBIA1301 NoHYG rd29A CBF3构建成功 质粒构建过程见图12 C对12M R对34图11植物表达载体pCAMBIA1301 NoHYG rd29A CBF3质粒的PCR检测 C对为CBF3阳性对照 1 2为CBF3质粒扩增产物 M dl2000 自上至下片段大小如右图所示 R对 为rd29A阳性对照 3 4为rd29A质粒扩增产物 2000bp1000bp750bp500bp200bp100bp南 京晓庄学院xx届本科毕业论文18T4DNA连接酶双酶切rd29A南京晓庄 学院xx届本科毕业论文19图12pCAMBIA1301 NoHYG rd29A CBF3质粒构建过程rd29A双酶切T4DNA连接酶南京晓庄学院xx届本科 毕业论文20将已经进行分子检测初步确认含有pCAMBIA1301 NoHYG rd29A CBF3重组质粒的大肠杆菌繁殖后 取出少量菌液送南京金斯瑞生物 科技有限公司测序 测序结果最终证明载体构建成功 3 讨论3 1植物遗传转化中的剔除标记基因的研究标记基因是筛选和 鉴定转化的细胞 组织和转基因植株的有效方法 标记基因分为两种 分别为起富集转化细胞作用的选择基因和易于 检测表达产物的报告基因 目前转基因植物中采用的选择基因主要分为抗生素类和抗除草剂类 等 其中抗生素抗性标记基因 如潮霉素抗性基因 g18 氯霉素抗性基 因等 应用最多 众所周知 杂交可使作物累积多个优良性状基因 同样植物遗传转 化技术通过重复转化改良作物 也能使栽培品种获得多个优良性状 并比杂交更为有效 目前转基因中所应用的转化系统只能使一小部分的细胞稳定转化 使用标记基因有利于转化细胞的筛选 但不利于细胞的多重转化 在第一次转化中使用了某一标记基因 在随后的转化中就要使用不 同的标记基因 在进行多重转化中 人们希望导入更多的优良性状基因 而不是标 记基因 因此在多重转化中应考虑剔除标记基因 剔除潮霉素抗性标记基因有利于提高多基因转化的效率 本实验正 是为今后采用基因的多重转化技术作准备 3 2植物基因rd29A启动子与CBF3的研究诱导型启动子是植物基因工 程中所应用的三种启动子类型之一 通常诱导型启动子又因功能性人为地被分为三种类型 其中胁迫诱 导型启动子rd29A属于可被外界环境如高低温 高盐 干旱等环境因 素所诱导的启动子 拟南芥rd29A基因既受低温诱导 也同时响应干旱 盐渍胁迫等 原 因是rd29A基因启动子区域内存在一脱水响应元件 DRE 也能同 时对低温和盐胁迫作出应答 向拟南芥转移DRE的表达活性cDNA 能 显著提高植株对包括低温 盐渍和干旱在内的所有脱水相关胁迫抗 性 低温与脱水胁迫之间抗性的交叉性 主要启动子信号转导的共性 Y amaguchi shinozaki等人研究证实 rd29A编码的蛋白质序列与脱水相关蛋白L EA家族非常相似 证明了他们在功能上的相似性 rd29A蛋白是拟南 芥响应低温和脱水胁迫的共同产物 反过来它又对植物脱水细胞伤 害起保护作用 其作用机理目前还不十分明确 进化树分析结果表明 亲缘最近的CBF基因家族分布在拟南芥的4号 染色体上 能够快速激活 15min 冷诱导且不依赖脱落酸 ABA 进 行高效表达 大量实验表明 CBF1或CBF3基因在植物中过量表达可提高植株内脯 氨酸和可溶性糖等耐寒 耐旱 耐盐物质的含量 研究结果显示对 于植南京晓庄学院xx届本科毕业论文21物的耐寒性 耐旱性 耐盐 性有显著的提高 应用转录因子CBF基因相对于非转录因子基因的优势是可以改良植物 的多个性状 所以转录因子基因更加高效 参考文献 1 王福兰 拟南芥rd29A启动子驱动的BADH基因植物表达载 体的构建及其转化烟草的研究 D 硕士学位论文 甘肃农业大学 xx 6 2 常菊芹 拟南芥CBF3和rd29A基因启动子的克隆及活性检测 D 硕士学位论文 大学 xx 6 3 Mansfield T A Hormones asregulators ofwater balance M In PlantHormones andTheir Rolein PlantGrowth andDevelopment 1987 411 430 4 Kazuko Yamaguchi Shinozaki Masahiro oizumi Satomi Uraoand KazuoShinozaki Molecular cloningand characterizationof9cDNAs forgenes thatare responsiveto desiationin Arabidopsisthaliana sequence analysisof onecDNA clohat encodesa putativetransmembrane channelprotein J Plant CellPhysiology 1992 33 217 224 5 Mie Kasuga Qiang Liu Setsuko Miura Kazuko Yamaguchi Shinozaki Improving Plantdrought salt and freezingtolerance bygene transferof asingle stress inducible transcriptionfactor J Nature Biotechnology 1999 17 287 291 6 Mundy J and Chua N H Abscisc acidand water stress inducethe expressionof anovel ricegene J EMBOJ 1