SNP开发验证的研究方法和技术路线

精品文档 1欢迎下载 SNP 开发 验证的研究方法和技术路线 1 分子标记 分子标记 我想这部分是我们分子标记组最核心的任务 现在 我们没有 任何可用的标记检测我们的定位材料 即使想要验证已经定位的 QTLs 我们也 需要相对应的区间内的分子标记 尤其是 SNP 标记 1 1 全基因组 SNP Affymetrix 芯片 一套完整的全基因组的 SNP 芯片 相对于 Douglas 体系 其操作简单 高 通量 可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析 在国家玉米改良中心 有一套 3k 的 Illumina 芯片 就是用来对玉米材料进行 高通量检测 基因型检测结果通常可以用来 QTLs 初定位 育种材料的群体划分 与纯度鉴定以及低密度的关联分析等 在此 我建议我们应该开发一套番茄基 因型检测的芯片 目前 只是查找到 Illumina 芯片有一套全基因 SNP 信息 包含 7 720 条探 针 而 Affymetrix 公司目前并没有相应的产品 但是通过跟 Affymetrix 公司 了解 可以利用 Illumina 芯片已有的结果进行开发 番茄目前测序结果显示其全基因组大小为 760Mb 而玉米为 2 500Mb 但 是他们包括的基因数目 30 000 个 整体情况相近 另外 番茄作为自交植物 其 LD 的衰减值应该更大 有效的历史重组会更少 遗传多样性低 因此 综合 考虑 我建议我们可以开发 3k 芯片 应该可以满足大多数研究材料 育种材 料的基因型检测需求 虽然目前下一代测序技术蓬勃发展 但是对于用于基因 型检测来讲 其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高 总之 我们番 茄处于刚刚发展阶段 我认为就基因型检测方面 芯片有其很高的应用价值 即使像玉米 这样测序技术发展很多年的材料 芯片技术也在应用 1 2 全基因组 SNP Douglas 当用 Affymetrix 芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后 1 对于优良的 QTLs 或是基因 我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行 精品文档 2欢迎下载 Douglas 系统进行分子标记辅助育种 2 对于需要进一步验证的 QTLs 我们也 可以利用 Douglas 系统只检测材料覆盖定位区间的基因型 而不需要再一次利 用 Affymetrix 芯片或是其他方法进行全基因检测 图 1 1 3 对于一些高信 息量 均匀分布在全基因的 SNP 分子标记 可以用来构建番茄的指纹图谱 因 此 一套完整能够与 Affymetrix 芯片相对应的 SNP 标记是必不可少的 图 1 1 QTL 区间上的 SNP 标记分布图 注 蓝色为深入片段 棕色为背景染色体 1 3 Douglas 系统下 SNP 标记的开发 通过建立稳定 可靠的番茄 DNA 提取流程与优化 PCR 反应体系 筛选具有 一致性 稳定性与多态性 SNP 分子标记引物 从而构建番茄全基因组 SNP 分子 标记 全基因组的 SNP 分子标记 可以用于番茄 QTL 定位群体的检测 分子标 记辅助育种的选择以及全基因组选择的群体基因型的检测 同时 从中挑选高 质量 高信息量的分子标记用于构建一套完成的番茄指纹图谱 检测品种一致 性 1 3 1 供试材料 22 份材料的 DNA 用作特异性引物筛选 2 份水作为 NTC None Template Control 共计 24 份模板作为 SNP 引物的初期筛选 以上实验在 Q6 仪器上进 行 对于筛选获得的一致性引物 在利用 94 株番茄自交系与 2 份水作为模板 进一步在 Douglas 仪器上验证 1 3 2 DNA 提取 1 取 10mg 植物组织 加入研磨介质和 400 l 裂解液 研磨 5min 3000g 精品文档 3欢迎下载 离心 5min 2 加入裂解液 1 3 体积的提取液 旋涡振荡混匀 冰浴 或置于 20 冰 箱中 5min 于 4 3200 g 离心 10min 吸取上清 300 400 l 加入到样品板 中 3 按照下表在各 96 孔板中加入试剂 板号板型板名成分样品及试剂体积 1Microtiter deep well 96plate 样品板 Lysis 样品反应液 无水乙醇 300 400 l 400 l 2Microtiter deep well 96plate 洗涤板I W1 PW 磁珠 800 l 30 l 3Microtiter deep well 96plate 洗涤板II W2 80 乙醇 磁套 800 l 4KingFisher 96 KF plate 洗脱板 Elution TE1 050 100 l 4 将各 96 孔板按仪器提示顺序放入仪器中 运行程序 5 程序运行结束后 将 DNA 溶液转移 PCR 板中并测量浓度 100ng l 进行后续实验或于 20 保存待用 1 3 3 分子标记命名 分子标记全部采用统一的命名规则 这样有利于结果的修改与维护 例如 名称 ID SNP 位点正向引物反向引物模板序列 SolBeckman 00001 V1Sol00001A G 引物合成 由上海生工公司负责引物合成 1 3 4 SNP 分子标记的开发 精品文档 4欢迎下载 最近 Sim 等人利用番茄的 Illumina 芯片检测 410 份自交系与 16 份番茄 品种的基因型 本研究在此基础上 利用 Illumina 开发的 7 720 条探针序列 选择其中丢失频率小于 10 等位基因频率大于 10 的探针序列 获得 3 500 条探针序列 作为 SNP 引物开发的模板序列 每条 序列的长度为 100bp SNP 上下游各 50bp 初期 我们可以从 3500 条探针中 选取 120 探针序列作为模板发展引物 这 120 条序列要求分布在 12 条染色体上而且在每条染色体上尽量保证均匀分布 如果实验成功 我们可以逐步地将剩余的探针序列发展成为 SNP 引物 1 3 5 正向引物设计 由于我们需要使用 KASP 基因分型检测试剂盒 本试剂盒对正向引物已经确 定为 SNP 位点上游 20bp 包括 SNP 位点 同时需要人工加上 FAM 或是 HEX 序 列 图 1 2 因此 我们需要单独设计反向引物 图 1 2 正向引物设计 1 3 6 反向引物设计 利用 Primer3 0 软件对模板序列进行引物选择 引物参数设定如下 1 引物长度为 18 25bp 2 GC 含量为 40 60 3 TM 值 58 62 C 如果其上述模板序列不足以满足引物开发的需要 我们可以利用剩余 4 200 条探针 继续开发新的引物 另外 我们还可以利用 PCR 产物测序的方 式获得 gap 中序列 寻找新的 SNP 位点 精品文档 5欢迎下载 1 3 6 PCR 反应 PCR 反应体系 PCR 反应体系需要保证均一化 这样可以满足将来在 Douglas 系统下进行 SNP 检测 初期我们会在 Q6 仪器上进行预实验 摸索一致 后 再在 Douglas 系统中进行 Primer Mix 反应体系 名称体积 l FAM Primer12 HEX Primer12 Reverse Primer30 ddH2O46 Total100 PCR 反应体系 名称体积 l Reaction Mix2 5 Primer Mix0 7 ddH2O0 8 DNA1 Total5 1 3 7 PCR 反应程序 我们的 PCR 产物应该都为 100bp 因此我们可以采用统一设定 保证均一 精品文档 6欢迎下载 化 采用两步法进行 PCR 反应 前期筛选引物我们设计 3 个复性梯度 60 C 57 C 以及 55 C 以便找到最合适的复性温度 首先 利用 60 C 的复性温度进行筛选 步骤参数意义 1 25 C 1 30min 反应前收集荧光 2 94 C 10min 预变性 3 94 C 15s 变性 4 60 C 1min 复性 延伸 5 3 4 重复 40 个循环 6 25 C 1 30min 反应完收集荧光 如果 SNP 引物在 60 C 复性温度时扩增结果正常 则保留该引物在 60 C 复 性进行 PCR 反应 如果得到引物扩增效果不好 则降低复性温度 利用 57 C 进 行复性 57 C 复性温度 PCR 反应程序筛选 步骤参数意义 1 25 C 1 30min 反应前收集荧光 2 94 C 10min 预变性 3 94 C 15s 变性 4 57 C 1min 复性 延伸 精品文档 7欢迎下载 5 3 4 重复 40 个循环 6 25 C 1 30min 反应完收集荧光 如果 SNP 引物在 57 C 复性温度时扩增结果正常 则保留该引物在 57 C 复 性进行 PCR 反应 如果得到引物扩增效果不好 则降低复性温度 利用 55 C 进 行复性 最终 如果 55 C 复性温度时 反应结果不好 则该 SNP 引物剔除去掉 55 C 复性温度 PCR 反应程序筛选 步骤参数意义 1 25 C 1 30min 反应前收集荧光 2 94 C 10min 预变性 3 94 C 15s 变性 4 55 C 1min 复性 延伸 5 3 4 重复 40 个循环 6 25 C 1 30min 反应完收集荧光 1 3 8 SNP 分子标记准确性验证 对于已在 21 份模板 DNA 扩增稳定的 SNP 引物 需要进一步在大群体中验证 其稳定性 一致性 多态性 选择 84 份番茄自交系或品种的 DNA 通过相同的 PCR 方法 验证新开发的 SNP 分子标记 1 3 9 目标要求 精品文档 8欢迎下载 番茄全基因组 SNP 标记 在番茄的全基因上 我们获得 1200 对特异的 SNP 引物 平均 100 对 染色体 覆盖番茄的全基因组 已获得在 12 份模板 DNA 能 够稳定扩增的 SNP 分子标记 全部保留 2 分子标记辅助育种 2 1 ILs 群体 如果利用现在群体不再进一步构建亚群体 ILs 群体 L pennellii 渐渗系 群体 76 个自交系 整个群体数目较小 不利于定位及 QTLs 验证 图 2 1 但是对于这些材料的渗入片段都已经注视清楚 因此我们可以直接比较深入系 与 M82 自交系的表型差异 如果存在显著性差异 则可以定义为有深入片段引 起的表型差异 当鉴定结果与已定位的 QTLs 信息一致时 我们就认为此 QTL 在 区间内 同时我们要检索此 QTL 定位时的位置 以此为基础发展 SNP 标记 用 于以后分子标记辅助育种 对于每个 QTL 的区间 需要发展 4 8 个 SNP 标记覆盖其定位区间 图 1 1 其中 区间外两段各一个标记 内部 2 6 个 SNP 标记 这样可以保证目标 QTL 被完整的应用 SNP 标记的开发 此时的 SNP 标记只需要在 ILs 群体的两个亲 本中有多态性就可以应用 引物设计同全基因组 SNP 引物设计相同 性状验证 对于确定的 QTLs 我们需要开发对应的 SNP 标记 利用这些标 记重新验证定位结果 精品文档 9欢迎下载 图 2 1 深入系材料的基因型 2 2 IBLs 群体 IBLs 群体本身就是分离群体 因此可以直接用作定位 图 2 2 如果该群 体基因型已经被鉴定 我们可以直接利用鉴定的基因型结合我们自己调查的表 型 获得 QTL 初定位的结果 同时 利用 Affymetrix 芯片进行全基因组的 SNP 检测 然后与表型数据相结合进行分析 然后 需要查看定位的 QTL 区间内是 否存在 3 Douglas 系统下 SNP 标记 如果满足分子标记辅助育种的应用 可以 直接应用 如果 QTL 区间内的没有或是过少的 SNP 标记 则需要重新开发 SNP 标记 标记开发同上 精品文档 10欢迎下载 图 2 2 IBLs 群体构建 2 3 性状调查 从我的观点出发 对于分子育种比较有价值研究的 QTL 应为育种家需求 的性状所对应的 QTL 我认为我们需要跟番茄育种家合作并讨论育种需求与育 种目标 鉴于目前 ILs 群体定位情况 表 1 表 2 我认为我们可以从中选择一些 我们能够鉴定测量的性状进行研究 例如 糖分 可溶性固形物的含量 果实 形状与大小等 总之我们要能够测量这些性状 同时 对于需要研究性状 我们需要对其进行界定 比如果实大小 我们 需要测量成熟后几天的果实 作为统一的判定 以保证性状测量的准确性 精品文档 11欢迎下载 为了能够获得准确的田间试验数据 应该采用良好的田间试验设计 在此 建议 现有的两个群体材料都为永久性群体 一般可以采用随机区组或是裂区 设计 每个系 2 3 个重复 鉴定表型 因此我认为我们应该进行田间实验设计 保证表型数据的准确性 3 SNP 指纹图谱构建 通过已经获得的全基因 SNP 分子标记 进一步可以从中挑选出稳定 一致 的 48 对 SNP 分子标记构建番茄的指纹图谱 挑选参数为 3 1 等位基因频率 Allele Frequency 在一个二倍体的某特定基因座上某一个等位基因占该基因座上等位基因总 数的比率 是群体遗传结构的一个最基本的尺度 该基因座上所有等位基因的