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精品文档 1欢迎下载 一株发酵产黑色素的枯草芽孢杆菌及发酵产黑色素的方法一株发酵产黑色素的枯草芽孢杆菌及发酵产黑色素的方法 技术领域 本发明属于生物工程发酵技术领域 具体涉及通过枯草芽孢杆菌液体发酵生产黑色素 及提取方法 背景技术 黑色素是一种广泛存在于生物体中的一类天然色素 是酪氨酸经过一连串的化学反应 形成的 通常以聚合的方式存在 黑色素可以作为吸收紫外线的化妆品成分 天然染发剂 的成分 以及生物杀虫剂的光保护剂尤其是应用于化妆品 因其具有吸收紫外线的作用 可以保护皮肤 色素有很多重要的生物学功能 它能通过与蛋白质的交联起到强化结构的作 用 同时黑色素还能提供一些机械力 并且保护蛋白质不被降解 此外黑色素在医学上也具 有很广的应用范围 具有清除自由基 阻止心磷脂脂质体的氧化 抗辐射及抗氧化 对病 理学和分类学的研究具有重要意义 作为新型的天然药物载体 用来治疗某些与黑色素缺 乏相关的神经性疾病 例如白癜风是常见的一种由于黑色素的缺失而引起的一种疾病 目前 黑色素既可以通过酪氨酸或其衍生物的氯化进行化学合成 也可以从动植物材 料中提取 还可以利用微生物合成 但现在大规模生产黑色素仍以化学合成法为主 例如 一种以哺乳类动物的毛发为原料和一种以黑芝麻味原料 用氢氧化钠溶液浸提后采用盐析 作为沉淀剂使黑色素沉淀来制取黑色素的方法 但随着人们对以化学原料合成黑色素安全 性问题的认识 现越来越倾向于对天然黑色素的开发和应用 尤其倾向于用微生物液体发 酵生产黑色素 天然黑色素安全性高 成分确定可操作性强 尤其是采用微生物发酵生产黑色素具有 反应条件温和 操作简单 低成本等特点 现在国内对利用微生物发酵生产黑色素的研究 还较少 本发明是利用枯草芽孢杆菌液体发酵生产黑色素 精品文档 2欢迎下载 发明内容 本发明针对现有黑色素合成工艺的不足 提供一种利用微生物液体发酵生产黑色素并 提取的方法 本发明所用菌株为枯草芽孢杆菌 现已保藏在中国微生物菌种保藏委员会 普通微生物中心 CGMCC 保藏编号为 本枯草芽孢杆菌 属于革兰氏阴性菌 本发明的技术方案 通过枯草芽孢杆菌的液体发酵生产黑色素 其过程包括菌种的斜 面培养 种子液培养 摇床发酵培养 深层液体发酵培养和黑色素的提取 本发明的具体步骤为 1 发酵菌种的准备 取保存在 80 的枯草芽孢杆菌接种于于固体培养基中 划线培养 培养温度 36 38 培养时间 48 72h 挑取单菌落作为种子菌 固体培养基的配制方法 成分为蛋白胨 1g 葡萄糖 0 1g NaCl0 5g CaCl2 0 01g L 酪氨酸 0 1g 琼脂粉 1 5g 然后用去离子水定容到 100ml 调节 PH 为 7 0 最 后在温度 121 高压蒸汽灭菌 15 20min 冷却制得固体平板 2 种子液发酵培养 将固体平板菌接种于种子液中 在温度 36 38 转速 181r min 培养 12 16h 培养至对数期 种子液的配制方法 成分为蛋白胨 1g 牛肉膏 0 5g NaCl1g 然后用去离子水定容至 100ml 调节 PH 为 7 0 分装到若干个 250ml 摇瓶中 在温度 121 高压蒸汽灭菌 15 20min 冷却得到种子液 3 将种子液进行放大培养 取上述 2 种子液按接种量 6 V V 接种于发酵培养基 中 在温度 36 38 转速 181r min 培 22 26h 然后加入 L 酪氨酸 0 1g 100ml 再 继续培养 20 30h 发酵培养基制备 成分为氮源 1 5 2 5 碳源 精品文档 3欢迎下载 1 5 2 5 NaCl0 4g KH2PO4 MgSO4 7H2O 0 02g KNO31g NH4 2SO4 1g 玉米粉 1g 然后用去离子水定容到 100ml 调节 PH 为 7 0 在温度 121 高压蒸汽灭菌 20min 制得 发酵液 上述 3 中发酵液 氮源可为酵母膏 尿素中的一种或多种 碳源可为麸皮 蔗糖 乳糖中的一种或多种 深层通风液体发酵培养 5 发酵液中黑色素的提取 发酵结束后将枯草芽孢杆菌黑色素发酵液过滤或者离心除去菌体 取发酵液浓缩 用 5mol LHCl 调 pH 值至 2 3 充分振荡 静置 40 100min 在搅拌的同时加入等体积有机溶 剂使其充分沉淀 用滤布过滤弃上清 得黑色粗提物 于 50 真空干燥至恒重 所述发酵液离心转速为 5000 8000r min 离心 10min 除去菌体 所述有机溶剂为无水乙醇 无水甲醇或无水丙酮中任意一种 所述有机溶剂为浓度 40 100 的乙醇 所述黑色素发酵液的浓缩比为 50 所述静置可以为恒温水浴中静置 水浴温度为 0 100 所述水浴温度优选为 80 本发明制备黑色素的优点 本发明方法制备的黑色素具有安全 简单 高效等优点 在 化妆业 工农业 医药业具有广泛的应用前景 产自枯草芽孢杆菌的黑色素降低的生产能 耗 缩短的生产周期 对环境危害小 于国家倡导的可持续性发展相结合 精品文档 4欢迎下载 具体实施方式 下面结合具体事例对发明做详细介绍 本发明所用菌种为枯草芽孢杆菌 现已保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通 微生物中心 CGMCC 保藏编号为 本枯草芽孢杆菌 属于革兰氏阴性菌 实施例一 种子液的培养 1 发酵菌种的准备 取保存在 80 的枯草芽孢杆菌菌种于固体培养基中 划线培养 培养温度 36 38 培养 48 72h 挑取单菌落作为种子液菌种 固体培养基的配制方法 成分为蛋白胨 1g 葡萄糖 0 1g NaCl0 5g CaCl2 0 01g L 酪氨酸 0 1g 琼脂粉 1 5g 然后用去离子水定容到 100ml 用 NaOH 或 HCL 调节 PH 为 7 0 在温度 121 高压蒸汽灭菌 15 20min 冷却制得固体平板 2 枯草芽孢杆菌种子液培养 将固体平板菌接种于种子液中 在温度 36 38 转速 181r min 培养 12 16h 培养至对数期 种子液的配制方法 成分为蛋白胨 1g 牛肉膏 0 5g NaCl1g 然后用去离子水定容至 100ml 用 NaOH 或 HCL 调节 PH 为 7 0 分装到 2 个 250ml 摇瓶中 在温度 121 高压蒸 汽灭菌 15 20min 冷却得到种子液 实施例二 摇瓶发酵培养 取上述枯草芽孢杆菌种子液按接种量 6 V V 接种于发酵培养基中 在温度 36 38 转速 181r min 培 22 26h 然后加入 L 酪氨酸 0 1g 100ml 再继续培养 20 30h 发酵培养基制备 成分为氮源 1 5 2 5 碳源 1 5 2 5 NaCl0 4g KH2PO4 MgSO4 7H2O0 02g KNO31g NH4 2SO41g 玉米粉 1g 然后用去离子水定容到 100ml 调节 PH 为 7 0 在温度 121 高压蒸汽灭菌 20min 制得 精品文档 5欢迎下载 发酵液 上述发酵培养基中 源可为酵母膏 尿素中的一种或多种 碳源可为麸皮 蔗糖 乳糖中的一种或多种 实施例三 深层通风液体发酵培养 实施例四 发酵液中黑色素的提取 发酵罐装液量为 15L 接种量为 6 V V 溶氧量 20 37 181r min 在 24h 后加 入 L 酪氨酸 0 1g 100ml 培养 2 3d 发酵结束后将枯草芽孢杆菌黑色素发酵液过滤或者离心除去菌体 取发酵液浓缩 用 5mol LHCl 调 pH 值至 2 3 充分振荡 静置 40 100min 在搅拌的同时加入等体积有机溶 剂使其充分沉淀 用滤布过滤弃上清 得黑色粗提物 于 50 真空干燥至恒重 所述发酵液离心转速为 5000 8000r min 离心 10min 除去菌体 所述有机溶剂为无水乙醇 无水甲醇或无水丙酮中任意一种 所述有机溶剂为浓度 40 100 的乙醇