免疫缺陷小鼠在白血病研究中的新进展

1 / 15免疫缺陷小鼠在白血病研究中的新进展作者：李仲霞 王跃嗣 贾秀红 【关键词】 免疫缺陷小鼠，模型；白血病 免疫缺陷动物是指由于先天性遗传缺陷或用人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。它源于 1962年苏格兰医师 Issacson 等首先发现的无胸腺裸小鼠。1969年，丹麦学者 Rygaard 首次成功的将人类恶性肿瘤移植于裸小鼠体内，在裸小鼠体内存活并生长，开创了免疫缺陷动物研究和应用的新里程碑。近三十多年来对免疫缺陷小鼠有了深入的研究，相关品系因此建立，并广泛应用于医学生物学研究，尤其在肿瘤学、免疫学中的应用。笔者综述了免疫缺陷动物的发展现状以及其在白血病研究中的应用新进展。 1 免疫缺陷小鼠的概况 SCID 小鼠(严重联合免疫缺陷小鼠 ) 1983 年 Bosma 等发现 纯系小鼠 16 号染色体上的重症联合免疫缺陷(SCID) 基因发生隐性突变后，小鼠缺乏功能成熟的 T 和 B淋巴细胞而称为 SCID 小鼠。该小鼠胸腺、脾、淋巴结的重量不及正常的 30% ，体内 T 和 B 淋巴细胞联合缺陷, 是建立急性淋巴细胞白血病 的有效模型，应用广泛。另外，Ohsugi 等使用 5、7、9、11 周的 B?17 scid/scid 2 / 15(SCID) 小鼠来建立模型 , 结果 5 周龄的小鼠 100% 有肿瘤形成，7 周龄小鼠肿瘤形成率为 50%，9 周龄小鼠为20%，11 周龄的小鼠没有大体肿瘤形成。说明小鼠周龄对模型的建立也有重要影响。 NOD/ SCID 小鼠(非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷小鼠) SCID 小鼠 NK 细胞及巨噬细胞功能正常。有 2%23%的小鼠出现淋巴细胞免疫功能恢复(渗漏现象)，这明显影响了 SCID 小鼠的更广泛应用。为提高人类肿瘤异种移植的成功率，人们将 SCID 小鼠与不同遗传背景品系小鼠杂交，NOD/ SCID 由此产生。这种小鼠是 SCID 小鼠与糖尿病小鼠的杂交产物，它不仅有 SCID 小鼠的 V(D)J 重排缺陷，还缺乏功能性 NK 细胞及循环补体, 抗原呈递细胞分化及功能不良，并且不发生自身免疫性糖尿病，由于 SCID 基因抑制了淋巴细胞的成熟，NOD 特异性基因抑制了先天免疫，因而是一种免疫缺陷更严重、更易于异种移植成功并可稳定应用的动物模型。NOD/SCID 是最易于建立 AML 模型的免疫缺陷小鼠，如 Ninomiya 等使用该种小鼠研究维 A 酸综合征(RAS)的病理生理机制。 NOD?scid IL?2rgamma(null)鼠 2002XX 年又有不同学者分别独立研究了一种更为有效的小鼠模型，此研究是在 NOD?SCID 小鼠模型的基础上导入一个靶向突变，即IL?2 受体 链缺失突变。已有报道 NOD?scid 3 / 15IL?2rgamma(null)鼠在人类淋巴造血系统移植物植入和功能方面明显优于 NOD?SCID 小鼠 。这种免疫缺陷小鼠缺乏适应性免疫功能，在固有免疫中表现多种缺陷，并且有助于提高人类淋巴造血系统移植物植入水平 。 其他免疫缺陷小鼠 2000 年，带有 IL?2rg null 基因的NOD/Shi?scid IL?2rgamma null (NOG)小鼠品系终于建立并能维持高繁殖效率。随后，有学者将人类造血干细胞( HSC)移植入这些小鼠中后，证明它们是非常有效的人源小鼠，是研究人类疾病的更为有效的工具。此品系小鼠是由IL?2rgamma null 鼠和 NOD/Shi?scid 小鼠回交后的第十代。将 NOD?SCID 小鼠的骨髓细胞通过尾静脉输注给经半致死量射线照射的 BALB/C 后，成为嵌合小鼠6 ，该小鼠容易植入人的组织细胞，包括造血系统肿瘤细胞。另外，Norn?Nystr?m 等用 T 淋巴细胞白血病(TLL) 动物模型来评价血管形成抑制因子 TN P2470 的抗肿瘤效应时使用的是 C57BL /6 小鼠。 2 免疫缺陷小鼠?人白血病模型的建立 在免疫缺陷动物体内移植人类肿瘤是研究恶性肿瘤的重要手段，特别是对人类白血病模型的研究较为成熟。但是人急/慢性白血病模型建立的条件不一样。一般情况下，AL细胞比 CL 细胞易于在 SCID 鼠体内移植成功。与 CL 细胞不4 / 15同的是，移植 AL 细胞不用预先给予促进白细胞生长的细胞因子，移植时一般输入 11072107 的单个核细胞，最少时仅 100 个白血病细胞就足以引起 SCID 鼠发生白血病，而移植 CL 细胞时则需要约 510710107 的单个核细胞才可引起白血病的发生。 国内外研究者们相继报道了急性淋巴性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)和慢性淋巴性白血病(CLL)的 SCID 小鼠模型的建立。如 Feuring?Buske等将原始的人 AML 细胞移植到 ?2 微球蛋白缺陷的NOD/ SCID 小鼠及转人类生长因子基因的转基因 NOD/ SCID小鼠体内，成功建立了白血病模型。Ramshaw 等9发现在体外半固体培养基上用人粒细胞?巨噬细胞集落刺激因子拮抗剂 E?1R 可抑制全部 CML 患者 CML 细胞的克隆形成，继而他们将人 CML 细胞(1108 细胞/只)分别输入 SCID 鼠和人 GM?CSF 转基因 SCID 鼠体内，发现人 CML 细胞在 SCID 小鼠体内难以定植，而在转人 GM?CSF 基因的 SCID 小鼠体内6 周后 CML 细胞数量可达到高峰，证明人 CML 细胞在体内、体外生长均依赖人 GM?CSF。Nicolini 等10用表达人特异性造血生长因子 IL?3、GM?CSF 的逆转录病毒载体转染小鼠，然后用此小鼠骨髓细胞接种 NOD/SCID 小鼠，34 周后小鼠血清 IL?3、GM?CSF 可达 ng/ml 水平，将人 HSC 或胎肝细胞移植到这些 NOD/SCID 小鼠体内，和未转染造血生长因5 / 15子的 NOD/SCID 小鼠相比，人髓系白细胞数明显增加，人HSC 明显向髓系方向分化，而红系细胞和淋巴系细胞明显减少。以上两个实验说明 CL 模型的建立需要一定的细胞因子。另有研究报道一种增强表达绿色荧光蛋白(eGFP)的NOD/Scid 鼠模型建立起来，在这种小鼠体内标记红色荧光蛋白的人类和鼠肿瘤能在体内皮下或正常位点建立起来 。混合系白血病(MLL)基因重组在成人和儿童 AML中很常见，因而研究比较深入，特别是儿童病例中，但对于 MLL 基因的部分串联序列(PTD)的分子机制研究少有报道。Hayashi 等利用取自 11 岁 AML 患儿的 MLL?PTD 建立了一种新的细胞系，并命名为 KOPM?88。他们将 KOPM?88细胞接种于 NOD?SCID 小鼠，发现小鼠骨髓出现白血病浸润，而且由于压迫性脊髓病导致小鼠瘫痪。这是首次报道在动物活体内展示全身性的带有 MLL?PTD 的 AML。 3 免疫缺陷小鼠在白血病中的应用 在骨髓新生血管方面的应用研究 研究证实多种血液系统肿瘤存在明显骨髓血管新生现象 ，血管生成在白血病发病机制中起重要作用。基于此，有学者尝试建立 NOD /SCID 小鼠白血病微血管生成模型。注射白血病细胞组在 3周左右才建立白血病模型 。郭海霞等静脉注射 HL60 细胞和内皮细胞组 NOD /SCID 小鼠在 14 d 时出6 / 15现白血病症状，表现为全身白血病，可如实反映临床 AML发病快、全身弥散性扩散的特点。实验中小鼠经静脉注入人 EC, 在 HL60 模型鼠中骨髓微血管密度明显大于非模型鼠，证明人 EC 可被 HL60 趋化至骨髓，参与局部肿瘤血管生成，可能与 HL60 细胞分泌的血管内皮生长因子等因子有关，再次验证了白血病血管生成与白血病细胞增殖之间的相互作用。此模型可用于抗白血病血管生成及实验研究。另外，有实验证实人 EC 可归巢到白血病模型鼠骨髓血管局部参与血管生成却不增加总血管密度 。 在干细胞中的应用研究 有学者用 NOD/SCID 小鼠研究间充质干细胞在移植人脐带血 CD34+细胞和 AML 细胞移植中的作用。42 只 NOD/SCID 小鼠给予亚致死量放射，随后静脉给予各种细胞剂量的有或无 MSCs 的 UCB CD34+细胞。另外12 只小鼠同样给予亚致死量照射，接着静脉注射有或无MSCs 的 AML 细胞。这些小鼠中的 10 只，其 MSCs 用编码eGFP 基因的腺病毒载体修饰以示踪。结果表明 MSCs 促进UCB CD34+细胞在骨髓的移植成功，但对于 AML 细胞的移植没有发挥作用，且在静脉注入后能够进入包括骨髓的主要淋巴器 。而关于 HSC，Ishikawa 等进行了这样的研究：将纯化的人 CD34+或 hCD34+hCD38-脐带血通过面静脉移植入 NOD?scid IL?2rgamma(null)鼠。注射 105 hCD34+或 2104 hCD34+ hCD 38-脐带血细胞于所有实验小7 / 15鼠，结果人造血细胞以大约 70%的嵌合现象再生，这种造血细胞高百分率的嵌合现象移植后一直持续了 24 周之多。且hCD34+原代实验小鼠骨髓移植入第二代 NOD?scid IL?2 rgamma (null) 鼠中也能重新形成造血作用，表明NOD?scid IL?2 rgamma(null)新生小鼠可支持人 HSC 的自我更新。CD34+hCD38-脐带血细胞能分化成成熟血细胞。既然对人白血病发生机制的主要研究依赖于 NOD/SCID 成年体系，那么 NOD/SCID/IL?2 rgamma 新生鼠体系也许是研究恶性造血作用的有效工具 。 将人类干细胞或祖细胞移植入 NOD/SCID 小鼠的实验性研究常导致低 T 淋巴细胞重建。这是临床 HSC 移植后的一个主要问题。既然肿瘤坏死因子 (TNF)在体外 T 细胞定型和分化中发挥重要作用，Samira 等研究了 TNF在小鼠体内增强人 T 细胞发展中的潜在作用。他们在移植人类单核细胞前将 TNF 投给照射过的 NOD/SCID 小鼠诱导2?3 周，结果发现 TNF 在体内能快速提高人 T 淋巴细胞数量。 在白血病实验性治疗方面的应用 对 NOD/SCID 鼠移植瘤模型的药敏实验研究：近年来一些国外学者对 NOD/SCID 鼠移植瘤模型进行了化疗药物药敏实验的研究。Liem 等探讨了儿童 ALL 体内模型的8 / 15药物敏感性评价, 发现移植瘤模型的生物、遗传学特点及化疗敏感性可准确反映肿瘤的临床特点，而药敏结果与患者的临床疗效和生存期存在一定的相关性。此外，新型抗瘤药物的体内实验结果常不能获得体外培养系统中的抗癌作用 。因此，NOD/ SCID 鼠移植瘤模型的体内药敏实验变得更加重要，它可对肿瘤的治疗方案进行筛查，并在体内评价其疗效，用以预测并指导临床治疗方案的选择和设计。同时体内药敏实验的研究平台也有可能对放疗、内分泌治疗、免疫治疗、基因治疗及分子靶向治疗等治疗进行深入研究。 对免疫缺陷小鼠?白血病模型的实验性治疗研究：林祥华等分析了 Bcl?2 反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸抑制 HL?60 细胞在 SCID 小鼠体内致白血病作用，探讨应用Bcl?2 ASPO 体外净化白血病可行性。结果 ASPO 处理组HL?60 细胞 Bcl?2 表达下降，体外增殖抑制凋亡，在 SCID小鼠中不会产生白血病，且未有残留；SPO 组 HL?60 细胞不受影响，仍可在 SCID 小鼠体内广泛增殖浸润，产生白血病。甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)和巨噬细胞炎性蛋白?1(MIP?1)在成人 T 淋巴细胞白血病的体液恶性高钙血症的发病机制中有重要作用，PTHrP 的表达能被核因子kappaB (NF?kappaB)激活。Shu 等使用生物荧光鼠9 / 15模型来评估通过 PS?341 阻断 NF?kappaB 和通过 Zol 抑制破骨作用在 ATLL 和 HHM 的发展过程中的效果。发现 PS?341降低细胞的活力，促进凋亡并且体外下调 PTHrP 在 ATLL 细胞中的表达。为证明在活体内的情况，将 ATLL 细胞移植入NOD/SCID 鼠体内并用 PS?341 或 Zol 或 PS?341 和 Zol 联合治疗，另有一组用赋形剂治疗作为对照组。生物荧光成像和肿瘤细胞计数显示所有治疗组的小鼠其肿瘤明显缩小，而且血浆钙离子浓度显著降低。用 Zol 治疗后骨小梁体积增加，破骨参数降低。PS?341 可在体内降低 PTHrP 和MIP?1 在肿瘤细胞内的表达。结果显示 PS?341 和 Zol 能有效治疗对常规疗法反应很差的 ATLL 和 HHM。细胞毒药物CPEC 是胞苷三磷酸酶合成酶的非竞争性抑制剂，Schimmel等研究了 CPEC 及对于 NOD/SCID 小鼠体内的 ALL的抗肿瘤活性，结果只观察到较弱的抗白血病活性，然而这种抗白血病活性和严重的全身毒性相关，这种毒性并非对 NOD/SCID 小鼠白血病模型特异，相同的情况也在 Balb/c小鼠模型中发现。总之，尽管 CPEC 在体外抗肿瘤活性较好，但在人白血病模型小鼠体内的抗瘤活性较差并伴有严重的毒性。 针对白血病干细胞的实验性治疗研究：研究证明，白血病也有自己的干细胞。而启动白血病发生的白血病干细胞(LSC) 可能是研究治疗的理想靶细胞，因此特定的肿瘤10 / 15干细胞群体及其所表达的特殊标志对于确定靶细胞或靶分子具有重要的意义。最近 Cheung 等发现表达乙醛脱氢酶(ALDH) 的 AML 可能含有原始的 LSC，并提示此类患者预后较差。由此可见,在 NOD/ SCID 鼠模型上开展肿瘤干细胞的筛选并研究其特性具有重要的治疗意义。一项对CD33+ AML 的研究显示， CD34+ / CD38- /CD123+ AML 干细胞也表达 CD33，因此针对 CD33 的抗体有可能治疗AML 。Yilmaz 等发现抑癌基因 PTEN 通过抑制 mTOR 与 PI3 K/ Akt 信号通道来抑制 LSC 的增殖，并维持正常 HSC 的增殖，mTOR 的抑制剂雷帕霉素能起到杀死LSC 和保护 HSC 的作用。 4 免疫缺陷小鼠?人白血病模型的应用前景 在过去的 10 年中，NOD/SCID 小鼠被认为是小动物模型中用来研究淋巴造血系统移植的“金标准” ，多数研究都是基于 NOD/SCID 小鼠而完成。由于在免疫缺陷小鼠?人类白血病模型中白血病细胞的增殖和分化受到如同骨髓微环境一样的调控，因此为研究白血病增殖、分化及其调控机制提供了独特的条件。免疫缺陷小鼠模型还可以直接检测白血病细胞生长和播散的能力，评价某些已知在体外能杀伤或致白血病细胞凋亡的药物,成为判断患者预后以及探索新的白血病治疗手段的重要方法之一。同时，我们应11 / 15该考虑到小鼠与人类的细胞因子、粘附分子和细胞外基质的不同,在今后的研究中,可开发应用转基因小鼠来模拟人体微环境的一些条件，克服现有免疫缺陷小鼠的不足，更好地应用这些模型深入研究白血病发生发展、调控机制及治疗。另外，新近建立起来的 NOD?scid IL?2rgamma(null)鼠可用于造血作用，固有和获得性免疫，自身免疫性疾病，感染性疾病，肿瘤生物学，再生医学等，其应用比NOD/SCID 更为广泛。将这种模型推广必将带动多个领域的进一步发展。 Hayashi M, Kondoh K, Nakata Y,et of a novel childhood acute myeloid leukaemia cell line, KOPM?88, containing partial tandem duplication of the MLL gene and an in vivo model for childhood acute myeloid leukaemia using NOD/SCID mice. 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