M蛋白的检测与鉴定

1 5 M 蛋白的检测与鉴定蛋白的检测与鉴定 一 M 蛋白的基础知识 M 蛋白是浆细胞或 B 淋巴细胞单克隆大量增殖时所产生的一种异常免疫球蛋白 其氨基酸组成及排列顺序十分均一 空间构象 电泳特征也完全相同 本质为免疫球 蛋白或其片段 轻链 重链等 由于它产生于单一克隆 monoclone 又常出现于 多发性骨髓瘤 multiple myeloma 巨球蛋白血症 macroglobulinemia 恶性淋巴 瘤 malignantlym phoma 病人的血或尿中 故称 M 蛋白 这些 M 蛋白大多无抗体 活性 所以又称为副蛋白 paraprotein M 蛋白血症可分为恶性与意义不明的两大类 恶性 M 蛋白血症多见于多发性骨 髓瘤 包括轻链病 巨球蛋白血症 重链病 7SIg M 病 Solomen Konkel 病 半分子病及不完全骨髓瘤蛋白病 C 端基因缺陷 等 意义不明的 M 蛋白血症 monoclonal gammopathyof undetermined significance M G US 又分为两种 一种 是与其他恶性肿瘤 如恶性淋巴瘤 伴发者 另一种即所谓良性 M 蛋白血症 M 蛋白的检测方法主要有琼脂或琼脂糖电泳 免疫电泳 免疫固定电泳 选择免 疫电泳等 二 M 蛋白的鉴定 1 多发性骨髓瘤与巨球蛋白血症时的 M 蛋白检测和鉴定 1 血清总蛋白定量 90 的患者血清总蛋白含量升高 70 的患者 100g L 约 10 的患者正常或甚至偏低 如轻链病时 2 血清蛋白醋纤膜或琼脂糖电泳 M 蛋白在电泳时出现典型的单株峰 亦称 M 区带 特点是区带窄而浓 扫描时呈现尖高峰 在 区高比宽 2 在 区 1 此 M 区带可因 Ig 的不同而出现在在 2的任何区域 M 蛋白增殖的另一特 2 5 点是其他各区带明显减少 显示图像较简单 有时有的患者血中 M 蛋白并不高 这是 由突变细胞的 Ig 分泌能力决定的 这种病人的血清在电泳时 M 峰可不明显 易被其他 蛋白掩盖 需采用稀释血清成应用其他敏感方法如免疫固定电泳来检测 3 血清 Ig 定量 一般 M 蛋白所属 Ig 含量均显著增高 其他类 Ig 则正常或显 著减低 4 免疫电泳 正常人血清免疫电泳结果 可分辨出 20 多种蛋白成分 在阳极端有船形很浓 的沉淀线为白蛋白 通常 Ig 组分靠阴极端 最靠近加样孔者为 Ig M 依次为 IgA IgG 三者成平滑的连续沉淀线 多发骨髓瘤 多发性骨髓瘤分 IgG IgA Ig M IgI 和 IgE5 种 IgG 和 IgA 又分亚类 所有 Ig 的轻链又分两个型 因此 免疫电泳时变形沉淀线的位置随各分子 的电泳区带不同而异 从慢 2区皆可出现 IgG 1 多出现在慢 区 IgG 4 在 2区 M 蛋白与相应的抗重链血清 抗轻链血清形成迁移范围十分局限的浓密 的沉淀弧 由于此种病人血清中 Ig 含量甚高 免疫扩散时可出现抗原绝对过剩而不出 现沉淀线 此时需稀释血清重做 往往可获得满意结果 巨球蛋白血症 由于 IgM 分子大量增殖所致 在免疫电泳时 常常出现以下特征 一是沉淀线明显变形 正常 情况下 IgM 形成短小沉淀线 不易看到变形 当 IgM 大量出现时 则会使整个 IgM 沉淀线变形 二是抗原孔周围和电泳纵轴出现团块状沉淀 三是电泳时 IgM 组分无迁 移 这多是 Ig M 分子聚合 电泳不移动所致 5 尿本 周蛋白检测 定性检测 用热沉淀法和磺基水杨酸法 3 5 免疫电泳法 用待检尿浓缩后进行免疫电泳 大多数多发性骨髓瘤病人和轻链 病患者 仅出现一条致密的弓形弯曲的沉淀线 本法 60 80 的骨髓瘤病人和几乎 全部轻链病病人可检出尿本周蛋白 轻链白蛋白 戊二醛交联免疫电泳法 多发性骨髓瘤 华氏巨球蛋白血症及轻 链病可呈阳性 正常人阴性 本法尿本周蛋白检出率为 100 假阳性 4 尿中含有 200 g ml 时即可出现阳性结果 2 重链病时 M 蛋白检测与鉴定 与多发性骨髓瘤相同 免疫电泳时由于重链分子较 Ig 分子小 故迁移率快 电泳 位置较靠阳极侧 但重链病一般需选择免疫电泳证实 3 7SIg M 病时 M 蛋白的检测与鉴定 一般 Ig M 为五聚体 沉降系数为 19S 而 7S IgM 患者的 IgM 为单体 沉降系数 为 7S 证明 7S IgM 有两种方法 一种是在测定 Ig M 总量后 将被测血清 1 2 ml 过 Sepharose 6B 柱 再根据洗脱峰图用面积仪测出 7S Ig M 占总 IgM 的百分比 与 Ig M 总量换算即得 7S IgM 的绝对值 另一方法即为植物血凝素 PHA 选择电泳 此法 原理是五聚体 Ig M 可与 PHA 结合形成沉淀 而单体 IgM 不与 PHA 结合 在琼脂胶 中加入 PHA 后进行电泳 五聚体 IgM 被 P H A 所阻留 而 7S Ig M 继续向阳极泳 动 并可与随后加至抗体槽中的 Ig M 抗血清反应 形成单一沉淀弧 4 半分子病时 M 蛋白检测与鉴定 所谓半分子病 half molecule 是指此种 M 蛋白由一条重键和一条轻链组成 分子量是正常 Ig 分子的 1 2 或 1 2 因半分子病肽链往往有部分缺失 至今报 告过 IgG 和 IgA 的半分子病 除上述检测方法外 尚须对 半分子 进行特殊鉴定 方法有 4 5 免疫电泳法鉴定半分子 M 蛋白的迁移率 电泳时发现具有 IgG 或 IgA 的电泳 特征而迁移率明显快于二者时 泳向正极可达 2 区 应注意有无本病的可能 十二烷基硫酸钠 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 推算 M 蛋白的分子量 超速离心分析 测定 M 蛋白的沉淀系数 Fc 抗原决定簇的确定 用相应抗重链血清对比患者与正常人相应 Ig 的区别 5 测定免疫球蛋白轻链型筛选 M 蛋白 正常人有五类免疫球蛋白 其轻链有两种型 即 型或 型 对于每个 Ig 分子 而言 其轻链只有一种 不是 就是 但对一个体的 Ig 分子而言 则有 和 两种链型 且其比例基本上是固定的 即 约为 2 1 任何原因引起的 Ig 分子 多克隆增殖 如慢性肝病 系统性红斑狼疮 某些恶性肿瘤时 其 值不变 而 M 蛋白发生时 是单克隆细胞的恶性增殖 所以在 Ig 量明显增高的同时 其 比值必然发生改变 即一种轻链型的 Ig 分子增多 利用适当的方法 分别定量测定 血清中 型 Ig 分子的量 即可特异而简便地诊断 M 蛋白病 测定方法有两种 一是用浊度测定技术分别测定含 或 的 Ig 的量 一种是用单相免疫扩散法测定 型 型 Ig 的含量及比值 单扩法是在琼脂凝胶板上打孔 排列呈梅花型 中心 孔注入抗 抗 混合抗体 周围孔放正常人及患者待测血清 然后进行扩散 正常 血清与抗血清之间可见对称双线 若患者的 轻链 Ig 升高 其沉淀线向内移 而 线有不同程度向外移 双环间距增宽 若 轻链 Ig 含量增高 则表现为环距减小 融合或跨环现象 此外 该法对 IgG IgA IgD 类型的轻链诊断准确率较高 而对 Ig M 型诊断不够理想 其原因是 Ig M 分子大 扩散迁移率小 同时五聚体立体结构也影 响了抗轻链抗体与轻链结合 若用二疏基乙醇处理将 Ig M 解为单体 则阳性率大大提 高 5 5 6 良性 M 蛋