人cd59基因突变细胞模型的建立

1 / 8人 CD59 基因突变细胞模型的建立【摘要】 目的 建立表达人突变 CD59 的细胞模型，初步研究其活性。方法 以正常的 CD59 基因全长 cDNA 序列为模板，应用重叠延伸 PCR 法产生突变使 CD59 糖基化基序K41?H44 突变为 K41?K42，产生突变 CD59 基因，将其克隆于 pALTER 质粒中，构建出重组真核表达载体。应用脂质体介导法，与 pcDNA3 质粒共转染中国仓鼠卵巢细胞, 以 G418筛选阳性克隆。应用免疫化学染色及 Western blot 方法进一步检测突变 CD59 分子在转染细胞膜表面的表达。通过荧光染料释放试验，对突变 CD59 蛋白糖基化前后的补体限制活性进行检测。结果筛选出的阳性克隆细胞膜表面有突变CD59 分子表达。将细胞的裂解物进行 Western blot 检测证实，在相对分子质量 20 000 处可见 1 条与 CD59 相当的蛋白带。表达有突变 CD59 分子的阳性克隆细胞染料释放率低于对照组，糖基化后染料释放率明显升高。 结论 成功地获得了表达人突变 CD59 分子的细胞株。 【关键词】 基因 CD59 突变 中国仓鼠卵巢细胞 补体限制作用 ABSTRACTObjectiveTo establish a cell model expressing human mutant CD59 molecular, and study its biological activities. MethodsNucleotides 2 / 8within glycosylation motif were changed to a human mutant CD59 gene (from K41?H44 to K41?K42) by overlap extension PCR. The mutant CD59 gene was inserted into a eukaryotic?expressing vector pALTER to form a recombinant plasmid. CHO cells were co?transfected by the recombinant plasmid and pcDNA3 via lipofectamine method. Target protein expressed on the membrane of the transfected cell lines was detected by immunocytochemistry and Western blot. Fluorescence dye was used to study the complement restriction activity of the mutant CD59 before and after glycosylationResultsMutant CD59 was expressed on the surface of transfected CHO cellsThe dye release rate of positive clone expressing mutant CD59 molecules was lower than that of the control group. However, the rate accelerated after glycosylation. ConclusionA stable transfected cell model expressing human mutant CD59 is successfully established, which might lay the basis for further study of its biologic functions. KEY WORDSgenes, CD59; mutation; CHO; complement restriction activity 3 / 8CD59 是一种以糖基磷脂酰肌醇锚于细胞膜表面的糖蛋白,相对分子质量约为 20 000， 广泛分布于造血生成细胞和非造血生成细胞及多种组织细胞表面,并可以游离形式存在于尿液、唾液、泪液等多种体液中。CD59 具有多种重要的免疫功能1 ，其中最主要的作用是作为补体的调节蛋白，以同源限制的方式抑制攻膜复合体(MAC)C5b?9 的形成，保护自身正常的组织细胞免受补体损伤。然而据报道，CD59 可在糖尿病病人体内被糖基化失活，糖基化的 CD59 失去了 MAC 限制功能 ，MAC 插入内皮细胞导致了生长因子的释放，进而可引起血管增殖2 ，导致血管并发症的发生。 为了探讨人突变 CD59 的抗补体活性及其与糖尿病血管并发症之间的关系，我们构建了一种突变的 CD59 基因，并转入中国仓鼠卵巢细胞，以便进一步研究突变 CD59 的活性。1 材料和方法 材料 质粒与细胞株 pALTER 和 pcDNA3 以及克隆有 CD59 全长cDNA 序列的 pALTER 质粒，均由美国哈佛大学提供。CHO 细胞购自中科院上海细胞所。 主要试剂及工具酶 RPMI 1640 培养液，购自 HyClone公司。G418 选择抗生素，购于 Amresco 公司。LipofectamineTM 2000 为 Invitrogen 公司产品。 FITC 标4 / 8记的 CD59 单抗为 Immu?notech 公司产品。双羧乙基碳氧荧光素?四乙酰氧 甲酯为 Sigma?Aldrich 公司产品。彩色蛋白质 Marker 由美国哈佛大学提供 。EcoR 酶购自宝生物大连有限公司。 引物设计及合成 共设计两对引物，第一对引物用来扩增含突变位点及其上游序列的 DNA 片断，正向引物(FM)为：5?AAGTGTTGGAAGAAGGAGCAGTGCAATT?3；反向引物为：5?ATTAACCCTCACTAAAGGGA?3。第二对引物用来扩增含突变位点及其下游序列的 DNA 片断，反向引物为：5?ATTGCACTGCTCCTTCTTCCAACACTTG?3；正向引物为：5?TAATACGACTCACTATAGGC?3。其中 FM 和 RM 反向互补 。以上引物由上海生物工程公司合成。 方法 重组真核表达载体的构建 在原构建的重组质粒pALTER?CD59 的基础上，重新设计一对反向互补、含有突变位点的引物及一对通用引物。通过重叠延伸 PCR 产生特异位点诱变3 。将指导合成的 CD59 分子中的 H44 去掉，增加 1 个 K42,产生突变 CD59。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、纯化，并回收目的条带。将质粒 pALTER 及含有全长突变 CD59 基因的 PCR 产物用 EcoR 单酶切 ,并经 T4 DNA连接酶插入到 pALTER 质粒的 EcoR 位点，构建重组真核5 / 8表达质粒。通过转化、筛选、酶切鉴定挑选出目的片段正向连接的重组质粒，并对筛选的克隆进行序列测定、分析。细胞转染及筛选 重组质粒 mCD59?pALTER 对 CHO 细胞的转染，参照 Lipofectamine 2000 的说明书进行。以质粒突变 CD59?pALTER 与 pcDNA3 共转染 CHO 细胞，同时设不带突变 CD59 基因的空 pALTER 转染 CHO 细胞作为阴性对照。转染后 24 h， 将细胞作 110 稀释后传代，在含 800 mg/L G418 的 RPMI 1640 中培养约 2 周后，出现阳性克隆。挑取单个克隆，继续抗性筛选 2 周，其阳性克隆的后续培养始终在 G418 维持剂量下进行。经连续传代 10 次后，收集细胞，对表达产物进行鉴定。 克隆细胞株表达产物的鉴定 采用免疫化学染色方法：收集细胞，用 PBS 洗 3 次，涂片、乙醇固定后晾干。灭活内源性过氧化物酶后，依次与羊抗人 CD59 多克隆抗体、HRP?兔抗山羊 IgG 于 37 作用各 45 min，最后以 DAB 底物显色后镜下观察。 收集细胞，经裂解处理后，离心收集上清进行 Western blot 分析，将不同相对分子质量蛋白质分离并进行特定条带酶免疫染色，进一步确定 CD59 分子的表达。 荧光染料释放试验 用 BCECF/AM 荧光染料渗入法，测定突变 CD59 蛋白糖基化前后的抗补体活性。将细胞接种于6 / 896 孔板内，每孔 1104 个细胞。在接种突变 CD59?CHO 的孔中，半数孔中加入核糖作为实验组，另一半孔不加核糖作为对照组。培养 72 h 后，加入氰基硼氢化钠以稳定加合物并维持细胞体积及膜电位不变。然后置于 37 孵育 20 min，洗涤后每孔加入 BCECF/AM，再于 37 孵育 30 min使其渗入细胞内部。然后每孔加入自制的抗 CHO 细胞多克隆抗体 50 mL，置 37 水浴中 30 min。洗涤后，加入不同浓度的新鲜人血清，每孔 100 L，于 37 作用 1520 min。吸出上清，加入到 2 mL PBS 液中，测定其荧光强度。最后于每孔中加入 100 L 的细胞裂解液，以释放出细胞内部的 BCECF/AM，并测定荧光强度。所用激发波长为 500 nm，发射波长为 530 nm。荧光释放率的计算公式为：染料释放率=上清中染料释放的 FI 值/100% 。 2 结 果 重组质粒的鉴定 以 EcoR 对突变 CD59?CHO 进行酶切，可获得 1 条 496 bp 的电泳带，与所插入的片段的大小相一致。测序结果表明，突变 CD59?pALTER 质粒含有突变的 CD59 全长 cDNA 序列。 转染细胞株表达产物的鉴定 免疫化学染色结果显示，pALTER?CHO 不显色；而突变7 / 8CD59?CHO 阳性克隆的表面显棕色。Western blot 分析结果表明， 突变 CD59?CHO 的裂解产物中，可检出相对分子质量约为 20 000 的突变 CD59 蛋白，证实突变的 CD59 基因在转染的 CHO 细胞中获得表达。 突变 CD59 的活性检测 BCECF/AM 荧光染料释放试验表明，突变 CD59 具有补体限制性，糖基化后其活性下降。 3 讨 论 血管内皮是一个复杂的内分泌器官，它对于动脉粥样硬化的发生起到“第一道防线”的生理防御作用。内皮细胞功能异常在糖尿病血管并发症中扮演了至关重要的角色4 。许多资料表明，糖尿病病人血管内皮及肾脏中 MAC的沉积增加 。MAC 沉积的增加可以导致从 MAC 靶定的内膜释放生长因子如基底成纤维生长因子和血小板源性生长因子等6 ，而生长因子的释放可以刺激血管壁细胞增殖并可导致增殖性血管并发症的发生。人 CD59 作为补体调节分子，可以抑制 MAC 的形成，从而抑制由于 MAC 插入内皮细胞导致的生长因子释放而导致的血管增殖性并发症的发生。但糖尿病持续高糖血症可使 CD59 发生非酶糖化并损伤其功能。 采用重叠延伸 PCR 和基因重组技术构建了人 CD59 的一种突变体，使糖基化基序 K41?H44 突变为 K41?K42， 44 位8 / 8组氨酸由一无关氨基酸取代，然后稳定转染 CHO 细胞，从而获得突变 CD59 表达细胞株。根据抗原抗体复合物可激活补体从而导致靶细胞损