小麦叶片生理指标测定

小麦叶片生理指标测定小麦叶片生理指标测定 1 种子处理 1 0 1 氯化汞浸泡小麦种子 30 分钟 进行消毒 小麦种子放在较 大的培养皿中 2 将氯化汞倒入废液瓶 注意必须戴两层手套 因为氯化汞剧毒 且用完的手套不能碰实验室里其它的任何东西 以防污染 最好把 用完的手套放到 DNA 显色室中的废手套收集桶里 3 然后用无菌蒸馏水冲洗 3 遍以上 4 最后用倒入适量无菌水 稍微让水浸没种子表面 进行种子萌发 每天换次新水 2 小麦培养 1 在种子发芽以后 在芽长 1cm 左右的时候 将种子放入用网缝 好的塑料泡沫上 然后放入装有自来水的培养盒中 2 大概三天左右的时间 将水倒掉 换上 1 2 hoagland 营养液 配 方见下面的附件 每三天换一次营养液 3 小麦处理及指标测定 1 小麦培养两周后 在两叶一心期 用适当 PEG6000 浓度的 1 2hoagland 营养液换掉原营养液 各设一个对照 即没加 PEG6000 的 1 2hoagland 营养液 2 每隔 24h 取一次样 在 72h 后复水 即将 PEG6000 溶液倒掉 换成新配的 1 2hoagland 营养液 4 生理指标测定 1 相对含水量测定 鲜重测定 迅速剪取植物材料 装入已知重量的容器 或塑料袋 中 带入室内 用分析天平称取鲜 重 FW 饱和鲜重测定 将称过鲜重的植物材料浸入水中 数小时后取出 用吸水纸吸干表面水分 立即称重 再次将材料放入水中浸泡一段时间后 再次取出 吸干表面水分 称鲜重 直到两次称重的结果基本相等 最后的结果即为饱和鲜重 SFW 若事先已知达到水分饱和所用的时间 则可一次取得饱和鲜重的测量 定值 干重测定 提前把烘箱打开 温度升至120 把称过鲜重的植物材料装入纸袋中 放入烘箱内 120 杀青10min 然后把烘箱的温度降到70 左右 烘至恒重 取出纸袋和材料 放入干燥器中冷却至室 温 称干重 DW 取得以上数据后 按公式相对含水量 相对含水量 FW DW SFW DW 2 MDA 含量测定 一 目的一 目的 通过实验 掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法 二 原理二 原理 丙二醛 MDA 是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害 其组织或器官膜脂质发生过 氧化反应而产生的 它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系 测定植物体内丙二醛含 量 通常利用硫代巴比妥酸 TBA 在酸性条件下加热与组织中的丙二醛产生显色反应 生成 红棕色的三甲川 3 5 5 三甲基恶唑 2 4 二酮 三甲川最大的吸收波长在 532nm 但是测定植物组织中 MDA 时受多种物质的干扰 其中最主要的是可溶性糖 糖与硫代巴比 妥酸显色反应产物的最大吸收波长在 450nm 处 在 532nm 处也有吸收 植物遭受干旱 高 温 低温等逆境胁迫时可溶性糖增加 因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产 物含量时一定要排除可溶性糖的干扰 此外在 532nm 波长处尚有非特异的背景吸收的影响 也要加以排除 低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反应物在 53 2 450nm 处的吸光度值 所以在蔗糖 丙二醛与硫代巴比妥酸显色反应中需要有一定的铁 离子 通常植物组织中铁离子的含量为 100 300 g g 1Dw 根据植物样品量和提取液的 体积 加入 Fe3 的终浓度为 0 5nmol L 1 在 532nm 600nm 和 450nm 波长处测定吸光度 值 即可计算出丙二醛含量 三 材料 仪器设备及试剂三 材料 仪器设备及试剂 1 1 材料 材料 植物叶片 2 2 仪器设备 仪器设备 离心机 分光光度计 电子分析天平 恒温水浴 研钵 试管 移液 管 1ml 5ml 试管架 移液管架 洗耳球 剪刀 3 3 试剂 试剂 10 三氯乙酸 0 6 硫代巴比妥酸 TBA 溶液 石英砂 四 实验步骤四 实验步骤 1 1 丙二醛的提取丙二醛的提取 称取受干旱 高温 低温等逆境胁迫的植物叶片 1g 加入少量石英砂和 10 三氯乙 酸 2ml 研磨至匀浆 再加 8ml10 三氯乙酸进一步研磨 匀浆以 4000r min 离心 10min 其上清液为丙二醛提取液 2 2 显色反应及测定显色反应及测定 取 4 支干净试管 编号 3 支为样品管 三个重复 各加入提取液 2ml 对照管加 蒸馏水 2ml 然后各管再加入 2ml 0 6 硫代巴比妥酸溶液 摇匀 混合液在沸水浴中反应 15min 迅速冷却后再离心 取上清液分别在 532 600 和 450nm 波长下测定吸光度 A 值 五 丙二醛含量计算 五 丙二醛含量计算 由于蔗糖 TBA 反应产物的最大吸收波长为 450nm 毫摩尔吸收系数为 85 4 10 3 M DA TBA 反应产物在 532nm 的毫摩尔吸收系数分别是 7 4 10 3和 155 10 3 532nm 非特 异性吸光值可以 600nm 波长处的吸光值代表 按双组分分光光度法原理 建立方程组 解此方程组即可求出 MDA 及可溶性糖浓度 方程组 A450 85 4 10 3 C 糖 A532 A600 155 10 3 CMDA 7 4 10 3 C 糖 解得 A450 C 糖 11 71A450 mmol L 1 85 4 10 3 CMDA 6 45 A532 A600 0 56A450 mol L 1 公式中 A450 在 450nm 波长下测得的吸光度值 A532 在 532nm 波长下测得的吸光度值 A600 在 600nm 波长下测得的吸光度值 1 55 105为摩尔比吸收系数 C 糖 CMDA分别是反应混合液中可溶性糖 MDA 的浓度 1 1 按下式计算提取液中按下式计算提取液中 MDAMDA 浓度浓度 反应液体积 ml CMDA 1000 提取液中 MDA 浓度 mol ml 1 测定时提取液用量 ml 2 2 按下式计算样品中按下式计算样品中 MDAMDA 含量含量 提取液中 MDA 浓度 mol ml 1 提取液总量 ml MDA 含量 mol g 1 Fw 植物组织鲜重 g 附 附 hoaglandhoagland 营养液配方营养液配方 改良霍格兰配方 四水硝酸钙 945mg L 硝酸钾 506mg L 硝酸铵 80mg L 磷酸二氢钾 136mg L 硫酸镁 493mg L 铁盐溶液 2 5ml 微量元素液 5ml pH 6 0 铁盐溶液 七水硫酸亚铁 2 78g 乙二胺四乙酸二钠 EDTA Na 3 73g 蒸馏水 500ml pH 5 5 微量元素液 碘化钾 0 83mg l 硼 酸 6 2mg L 硫酸锰 22 3mg L 硫酸锌 8 6mg