感受态细胞操作步骤

1 感受态细胞感受态细胞 DH5 TOP10 操作步骤操作步骤 第一天第一天 1 配制试剂配制试剂 100mM CaCl2 7 35g CaCl2 2H2O 500 ml dd H2O 100mM MgCl2 10 15g MgCl2 6H2O 500 ml dd H2O 50 V V 甘油 1L LB 培养基 1L dd H2O 25g LB 粉末 75 V V 酒精 配制试剂 100mM CaCl2100mM MgCl2 称取相应质量的固体粉末将其转移到事先清洗 干净的烧杯里 若有容量瓶 使用容量瓶 用超纯水清洗量筒三次 加少量 dd H2O 到烧 杯溶解固体粉末 将烧杯里溶液加到量筒里 用少量 dd H2O 清洗量筒三次 将量筒定容到 500 ml 将溶液加到试剂瓶里 留待消毒 配制 50 V V 甘油 用量筒量取 250ml 甘油 甘油较粘稠 加时要小心慢加 将量好 后的甘油加到试剂瓶里 用另一个量筒量取 250ml dd H2O 用少量水清洗量取甘油的量筒 最终将所有 dd H2O 加到试剂瓶里 留待消毒 2 准备实验用品准备实验用品 1 个 500mL 摇瓶 2 个 2 L 摇瓶 加有锡箔纸 3 个无抗生素的 LB 平板 100ml dd H2O 3 7g LB 粉末 可倒 6 7 个平板 下午 1 点左右做平板 所有感受态平板侧面需划两条线 2 个 Kana LB 平板 100ml LB 加入 50ul kana 3ml 巴氏吸管 1 5ml 小管 使用没有拆封过的小管 不需灭菌 1ml 枪头 200ul 枪 头 4 个 400ml 离心管 每管实际装 350ml 液体 3 灭菌锅消毒灭菌锅消毒 100mM CaCl2 100mM MgCl2 50 V V 甘油 LB 培养基 dd H2O 若有灭菌水则不需灭 500 ml 摇瓶 2 L 摇瓶 1ml 枪头 200ul 枪头 6 个 100ml 离心管 灭完菌后拿到烘箱中 60 烘干 试剂则放到 4 冰箱中 4 涂布感受态细胞平板涂布感受态细胞平板 以 DH5 为例 pm 2 30 3 00 戴好手套 清理干净操作台 喷洒 75 酒精 将三个无抗性的 LB 平板放在工作台上 在底部标记上 DH5 及日期 倒 5 8 个 Beads 在第一个平板上 将 beads 倾到一边 在空白处加 10ul 灭菌的 dd H2O 第一个将 LB 平板 移液枪 枪头一起拿到 80 冰箱那的操作台上 从冰箱迅速拿出装 有感受态细胞的管子 三中感受态细胞的管子装在一个大袋子里 灰色为 DH5 紫色为 TOP10 管子上有标记 用枪头在管子中搅出一小冰块 将冰块加到 10ul 水上 盖好平 板盖子 将感受态细胞管子迅速放到 80 冰箱里 整个步骤要迅速小心 回到之前操作台 平行换方向摇第一个平板 3 4min 后将 beads 直接倒到第二个平板 beads 不能倒在平板 盖子上 平行换方向摇第二个平板 第三个平板操作同第二个 最后将 beads 倒回收集 瓶 将涂布了 DH5 的 LB 瓶正放在 37 烘箱中 10min 然后将其倒置过夜培养 结果第三 个平板应长出明显单菌落 且无其他杂菌污染 2 感受态细胞感受态细胞 DH5 T2A TOP10 操作步骤操作步骤 第二天第二天 pm 3 30 4 00 1 清洁操作台 喷洒酒精 2 用新的灭菌的 50ml 离心管量取 100ml LB 悬空加到 500ml 锥形瓶中 从第一天的 LB Agar 板子上选择一菌落 用枪头挑出少许 将挑出的少许菌落细胞加入上述 100ml LB 中 锡箔纸封口 在 37 180rpm 过夜摇 3 另外两个 2L 摇瓶用同样方法分别加入 400ml LB 培养基 封口 常温下放置过夜 以便于第二天检查是否污染 即看 LB 是否澄清透亮 第三天第三天 1 转菌转菌 am 7 30 观察 LB 培养基是否污染 无污染的话用 1ml 移液枪分别悬空转移 4ml 过夜培养的菌液 到 400ml 的 LB 培养基摇瓶 操作中移液枪不可碰到摇瓶的任何部位 将摇瓶置于 37 180rpm 开始摇 半个小时后打开紫外分光光度计预热 一个小时后开始监测菌液的 OD600 一般在两个 小时左右 OD600 达到 0 4 0 45 监测过程中遇到 OD600 到 0 35 以上时每隔 5min 监测一次 值 2 预冷预冷 将 100mM CaCl2 100mM MgCl2 50 V V 甘油 LB 培养基放入 4 冰箱预冷 将 3ml 巴氏吸管 1 5ml 小管 1ml 枪头 400ml 离心管 分装感受态细胞的盘子置于 20 预冷 开启蛋白间的空调 若冬天无需开 制冰机 离心机 4 预冷 喷洒 75 酒精在 蛋白间的工作台 3 制备制备 菌液 OD600 值达到 0 4 时 迅速将摇瓶置于冰上并转移到蛋白间 取出 6 个 80ml 离心 管将其置于冰上 将菌液悬空加入到离心管中 每管加入 80mL 菌液 配平离心 DH5a 活化细胞 7000rpm 5min T2A ccdB survival 细胞 7000rpm 5min TOP10 活化细胞 3000rpm 10min 悬空倒出上清液 将离心管立即置于冰上 用 50ml 干净离心管量取 35ml 12 5ml 50ml 预冷的 100mM MgCl2溶液加入离心管中 3ml 巴氏吸管温柔悬浮菌 液 此步骤在冰上操作 悬浮完全后离心 DH5a 活化细胞 6000rpm 7min T2A ccdB survival 细胞 6000rpm 7min TOP10 活化细胞 3000rpm 14min 3 感受态细胞感受态细胞 DH5 T2A TOP10 操作步骤操作步骤 悬空倒出上清液 将离心管立即置于冰上 用 50ml 干净离心管量取 30ml 35ml 分批 25ml 50ml 预冷的 100mM CaCl2溶液加入离心管中 巴氏吸管冰上温柔悬浮菌液 悬 浮完 全后 在冰盒中 放入 4 冰箱 放置 45 分钟 然后置于离心机中离心 DH5a 活化细胞 7000rpm 10min T2A ccdB survival 细胞 7000rpm 10min TOP10 活化细胞 3000rpm 20min 悬空倒出上清液 将离心管立即置于冰上 用 10ml 移液枪加入 7ml 2 5ml 50ml 预冷 的 100mM CaCl2溶液 巴氏吸管冰上温柔悬浮菌液 悬浮完全后 在冰盒中 放入 4 冰箱 放置 45 分钟 时间到后 将细胞混合到一个 50ml 的新的离心管中 估算体积 A 40mL 计算所需 加入的 50 甘油的体积 X 使其终浓度为 15 计算方法 X A 15 X 50 X 17mL 故总体积大于 57mL 按照此方法操作 一周可以做三批 这样可以做总体积大于按照此方法操作 一周可以做三批 这样可以做总体积大于 171ml 的感受态细胞 的感受态细胞 事先准备一个干净袋子写上 DH5a 日期 CX QC 开始分装 取出预冷的盘子置于冰上 然后取出 1 5ml 管子依次排列在盘子上并打开盖子 每个管子中加入 500ul 感受态细胞 加完感受态细胞的小管迅速放到冰上 分装完毕后将小管装入袋子后迅速放入 80 冰箱中 4 在感受态工作日志 存于电脑感受态工作日志 存于电脑 E 盘 盘 上填写相关信息 5 QC 检测检测 对在 80 冰箱中冻了一夜的感受态细胞进行 5kb 和 13kb 的检测 步骤如下 1 取出存于 20 Andy box 的 5kb 13kb 质粒和存于 80 的感受态细胞置于冰上 2 准备两个 1 5ml 管子分别标记 DH5a 5kb DH5a 13kb 每个管子分装 60ul 感受态细 胞 加入 1ul 质粒混合冰上放置 30min 42 45s TOP10 30s 热激后加入 150 ul LB blank 放在 37 摇床上 220rpm 孵化 1h 3 取出两个 kana LB 平板 分别标上 DH5a 5kb 日期 DH5a 13kb 日期 在每个平板上 倒 4 6 个 beads 将经过 1h 孵化的菌液加入到平板上 平行摇 4 5min 后倒掉珠子 将平板 于 37 烘箱中正方 10min 后倒置过夜培养 4 第二天观察平板上菌落情况 理论上菌落数 5kb 100 个 3kb 30 个 则 QC 通过 在装有感受态细胞的袋子上 QC 后面划个钩 感受态细胞制备完成 5 无质粒转化 看是否有 DNA 污染 分别做 3 个带抗性的 LB 摇管 50ml LB Kana 加 25ul kana 分装出 3ml 50ml LB Spec 加 50ul Spec 分装出 3ml 50ml LB Amp 加 60ul Amp 分装出 3ml Spec 和