胶体金使用问答

食品安全快速检测试剂盒食品安全快速检测试剂盒 1 问 食品安全速检测试纸的优势是什么 答 1 检测速度快 且具有一定的灵敏度和转移性 2 结构简单 携带方便 非常适合现场快速检测 3 操作简单 使用者不需专门培训就能掌握 4 价格便宜 不需要检修维护 一次性使用 目前试纸法已广泛应用于食品 水质 医疗卫生等各个领域 2 问 食品安全快速检测试剂盒的检测方法是什么 答 食品安全快速检测试剂盒采用的检测方法来源于国际法 教科书中经典的分析方法以及最新的科研成 果 并结合现场条件进行简化和改良 检测的灵敏度 稳定性 可靠性均达到食品卫生评价标准的要求 已研发出包括甲醛速测试剂盒 二氧化硫速测试剂盒 亚硝酸盐速测试剂盒 蛋白质速测试剂盒 苏丹红 速测试剂盒等在内的 60 多种速测试剂盒 5 问 胶体金检测卡的优势是什么 答 1 方便快速 所有反应能在 15 分钟内完成 2 成本低 不需要特殊的仪器设备 3 应用范围广 可适应多种检测条件 4 准确 假阳性率低 5 标记物稳定 标记样品在 4 贮存一年以上 无信号衰减现象 6 胶体金本身为红色 不需要加入发色试剂 对人体无毒害 一般企业会用自己检测与外部有资质的结构测试相结合 因为样品数量巨大 如果均外部 测试 意识费用非常高 二是送样 检测 获得结果的周期长 效率低 无法满足实际应 用的需求 所以自检也是顺应企业高效节约的宗旨 对自己用检测出值得怀疑的样本再送 检测机构检测 胶体金快速检测卡使用中常出现问题胶体金快速检测卡使用中常出现问题 胶体金快速检测卡使用中常出现问题 常见问题 异常情况原因分析建议处理方案 样品层析速度异常慢 无样本跑动 在检测 窗内不见有液体在膜 上流动 1 加样量太少 一般要求加 样为 40 80ul 2 样本过于粘稠或有沉淀物 如血块 3 该测试条已受潮失效 1 增加加液量或滴加少量辅助液 2 滴加少理辅助液 对样本进行预处理以去除沉淀 物 血清 血浆离心后使用 全血重新取样 3 更换新测试条重新检测 测试条尽量现拆现用 检测窗内出现红 紫色 坚线 该试纸条受轻微的物理损伤 该情况不影响检测结果 可在背景清晰后于规定时间内读 取结果 或更换新测试条重新检测 有大量全血溢出 NC 膜表面偏红 影响结 果判读 1 该测试条 NC 膜严重受损 机械损伤 或断裂 2 使用已溶血的全血标本 1 更换新测试条重新检测 2 尽量使用新鲜全血进行检测 层析时无红 紫红色背 景出现 该测试条已受潮失效更换新测试条重新检测 漏检率偏高 假阴性 1 检测时间太短 2 加样量太少 辅助液滴加 过量 样本被稀释 3 样本中被检物浓度太低 4 个别样本中含有较为特殊 物质或亚型 5 该测试条受潮 活性下降 或失活 1 按说明书要求正确判读 建议对于较弱阳性或阴 性标本至少 10 15 分钟判读结果 2 按说明书要求正确加样或辅助液 3 采用其它检测方法进行确认 4 更换新测试条重新检测 测试条尽量现拆现用 检测线 对照线不完整 该试剂条有轻微的物理损伤该情况不影响检测结果 也可更换新测试条重新检测 检测线与对照线之间 出现灰暗的阴影 测试条 NC 膜表面的透明胶带边沿 引起的视觉差异 该情况不影响检测结果 可在规定时间内读取结果 检测后出现假阳性结 果 1 该测试条灵敏度偏高 2 该样本含特殊干扰物或已 被污染 3 在规定的时间后判读结果 1 提前判读结果或更换新测试 条重新检测 2 用其他检测方法确诊检测结果 确保样本不受污 染 3 按说明书要求正确判读结果 30 分名钟后检测结 果可能不准确 呈色检测线比对照线 明显深黑 强阳性结果正常情况 不影响检测结果 检测线或对照相馆线 附近出现白斑或白色 条带 个别情况 NC 膜自身质量原因 生 产无法控制 该情况一般不影响检测结果 同一样本血清检出时 间快于全血标本 相同体积的血清标本含受检物的量 要高于全血标本 正常情况 不影响检测结果 NC 膜表面颜色较深 紫红甚至偏紫 测试刚开始该现象明显 3 5 分钟 后颜色就会明显褪去属正常现象 正常情况 不影响检测结果 ELISA 检测试检测试 剂盒使用指南剂盒使用指南 步骤常见问题解决方案 实验准备 1 加样器不准确 尤其 10ul 以下的加 样器 对结果影响极大 2 保温设备不良 3 洗涤用水不规范 1 校正加样器 10ul 以下加样器最好采用进口产 品 芬兰 法国等 2 仔细校正温度到 37 水浴箱为佳 3 必须使用去离子水或蒸馏水 不得用自来水 矿泉水等 4 认真阅读使用说明书 样品加样1 加样不准确 1 加样时一定要仔细 加样后 再检查 以防漏 2 没有混匀 加 错加 2 加样后 反复抽吸 3 次混匀 防止血清聚集孔 底 导致非特异性吸附 洗涤洗涤不彻底 1 每次注水洗涤 应静止 30 秒钟 2 选用吸水纸作为衬垫 每次洗涤后扣干孔内水 分 3 可选用塑料洗涤瓶 加酶反应漏加滴加后 认真检查各孔 结果判断 1 包括阴性对照孔在内 各孔显色普 遍偏深 2 包括阳性对照在内 各孔均无显色 3 阳性对照不显色 而其它样本显色 正常 4 有些标本显色不深 判断阳性困难 1 可能是洗涤不充分 加样过量 温育时间过长 温度过高 按说明书重新操作 如无改善 可与 生产厂家联系 2 可能是漏加样本或酶液 温育时间过短温度过 低 试剂保存不当活性下降 按说明书重新操作 如无改善 可与生产厂家联系 3 阳性对照漏加 错加或失效 重新操作 如无 改善 可与厂家联系 索要对照品 4 重新操作 最好使用酶标仪 测定光吸收度 按 P N 值标准判断 试剂保存保存不规范 一定要在 2 8 存放 不得过高 也不得冻存 冻存后 酶液将失效 对照品对照品为冻干品 按对照管标示 加入相应体积的去离子水或蒸馏 水复溶 充分溶解混匀 可按说明书使用 ELISA 试剂盒常见问题试剂盒常见问题 ELISA 方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定 但 ELISA 测定中影响因素较多 而且其操作中有一定的 技术要求 在检测过程中除正常反应外 有时常见到一些错误的结果 引起 ELISA 测定错误结果的原因 主要有 标本因素 试剂因素 操作因素 下面就一些常见 ELISA 操作过程中的问题一一分析 1 样品稀释 酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应 如果血清不稀释 不可避免会产生很强的非特异性反应 出现假 阳性 因此 国外检测血清抗体的试剂盒 均规定将血清稀释至适当的倍数 以降低非特异性反应 使特 异性的抗原抗体反应充分体现出来 一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定 以保证试验的灵敏度 和特异性 但是 有些用户未能严格按使用说明书操作 如某些产品应取 10 l 样品进行稀释 个别用户 取 5 l 甚至 1 l 样品进行稀释 由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够 因此造成样 品稀释倍数不准确 检测结果出现问题 2 试剂盒平衡 试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温 约 25 一般需在室温放置 20 30 分钟以上 平 衡时间太短会造成试剂混匀不够 样品孵育时间相对缩短 ELISA 反应不够充分 冬季室温低 可将试 剂盒置 37 温箱 20 分钟 3 样品和试剂的混匀 稀释前 后的样品必须充分混匀 所有试剂在加样前也须摇匀 以保证试验的均一性 4 加样 在现在的 ELISA 商品试剂盒中 必然有使用微量加样器加入样本的步骤 注意的关键点是 加样不可太 快 要避免加在孔壁上部 不可溅出和产生气泡 加样太快 无法保证微量加样的准确性和均一性 加在 孔壁上部的非包被区 易导致非特异吸附 溅出会对邻近孔产生污染 出现气泡则反应液界面有差异 所 以 有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性 下次测定为阴性 往往就是上述加样及试剂的错误 所致 5 温育 温育是 ELISA 测定中影响测定成败最为关键的一个因素 ELISA 作为一种固相免疫测定 抗原抗体的结 合反应在固相上进行 要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合 必须在一定的温度 条件下反应一定的时间 温育所需时间与温度成反比 即温度越高 则所需时间相对较短 最为常用的温 育温度有 37 和室温 其次是 43 和 2 8 一些操作者 擅自改变说明书操作 使用自己喜欢的温 育时间和温育温度 这样造成一些不必要的麻烦 因为 不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择 随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差 6 洗板 固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术 需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育 过程中吸附的非特异成份分离开来 以保证 ELISA 测定的特异性 洗板对于 ELISA 测定来说 也是极其 关键的一步 洗液尽量不要溢出孔外 加洗液后要静置 1 分钟 甩去板孔中洗液后 一定要大力拍干 及 时更换吸水纸 尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去 否则可能影响试验结果 7 边缘效应 使用 96 孔板的 ELISA 测定中 常发现有 边缘效应 即外周孔显色较中心孔深 经研究证实在温育中 的热力学梯度可能是根本原因之所 聚苯乙烯本身为不良热导体 在实验室的常规 ELISA 测定中 将板 从室温 通常在 25 左右 置于 37 温箱 板也升温时 在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度 因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时 将板和溶液均加热至温育温度 如 37 就可以很容 易地排除 边缘效应 并且可提高测定的重复性 8 显色 显色一定要控制时间 根据试剂盒说明操作即可 一般来说 显色时间过短 结果偏低 显色时间过长 空白增高或者非特异性显色增加 9 比色 比色要注意波长的选择 以 TMB 为底物和以 OPD 为底物的试剂盒均有使用 而前者比色波长为 450nm 后者为 492nm 滤光片需根据要求随时更换 因此 容易出现滤光片错用的问题 其次 单波长或双波长比色选择的问题 所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如 450nm 或 492nm 进行比色测定 而双波长双色则酶标仪在敏感波长如 450nm 和非敏感波长如 630nm 下各测定一次 敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹 刮痕 灰尘等脏物所致的吸光度之和 非敏感波长下测定即改变波长至一定值 使得样本测定酶反应特异 显色的吸光度值为零 此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值 最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸 光度值与非常感波长下的吸光度值的差 因此 双波长比色测定具有能排除由微滴板本身 板孔内标本的 非特异吸收 指纹 刮痕 灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点 由于 ELISA 测定中单个空白孔 的非特异吸收上有一定程度的不确定性 也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不 同吸光度测定值 故而在 ELISA 测定比色时 最好是使用双波长比色 综上所述 尽管 ELISA 测定的操作步骤非常简单 但有可能会影响测定结果的因素却较多 分布在测定 操作的各步之中 尤以加样 温育和洗板为甚 为帮助大家分析查找测定中出现问题的可能原因 特对常 见问题及原因归纳总结于下表 操作过程中可能出现的问题和解决方法操作过程中可能出现的问题和解决方法 问题问题 可能原因可能原因 解决方法解决方法 显色淡 灵敏度偏低 1 试剂盒在运输途中时间太长 温度太高 尽量缩短运输 时间 夏季应放冰块降温 2 试剂盒未充分平衡 试剂盒从 2 8 冰箱取出后打开盒盖 于室温平衡至 少 20 分钟 确保所有试剂已平衡至室温 约 25 3 培养箱温度不足 37 注意培养箱温度 放 入反应板后尽量减少开启次数以免影响温度恒定 非隔水式培养箱尤其应注意 4 保温时间不足 校正定 时钟准确定时 5 洗涤时冲击力太大 浸泡时间过长 洗涤次数增加 按说明书要求保留洗涤时间 准确 记住洗涤次数 6 移液器吸液量不足 吸嘴内壁挂水太多或内壁不清洁 校正移液器 吸嘴要配套 装吸 嘴时要紧密 吸嘴内壁要清洁 最好一次性使用 7 蒸馏水水质有问题 使用新鲜合格的蒸馏水 8 底物 作用时间不足 准确定时 背景深 全部呈有色 1 洗涤不充分 洗后未拍干 样品中其它成分残留或酶 标记物残留 浓缩洗液准确配制 10 倍浓缩洗涤液如有结晶则应让结晶于室温全部溶解后再量取稀释 充 分洗涤 彻底拍干 加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用 不要反复使用 否则易造成污染 2 样品污染 样品应新鲜采集 或低温保存 防止污染 3 培养箱温度超过 37 或反应时间过长 调整培养箱温度 准确定时 4 吸嘴重复使用 未洗净或消毒不彻底 吸嘴尽可能一次性使用 5 蒸馏水被污染 使用新鲜 蒸馏水 6 酶等试剂混用 不同批号试剂勿混用 7 一次实验的标本量过多 加样时间太长 导致实际反 应时间延长 合理安排实验 避免几块酶标板同时加样 重复性不佳 1 样品数量多少不一 加样时间有长 有短 重复某一样品时 加样时间尽可能与第一次接近 2 保温时间不一致 洗涤条件不一致 操作人员 不一致 重复测定标本 操作条件 人员等应尽可能与上次保持一致 以排除这些因素造成的不一致的可 能性 3 加样量不一致 样品稀释前应充分混匀 尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴 出现白板 阳性对照 不显色 显色液变质 更换新的显色液 洗涤液配制有误 请按说明书所示稀释倍数配制 未加酶结合物而认 为已加入 注意不要漏加 终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用 每次加液前均应看清标签 ELISA 实验操作中常见问题分析实验操作中常见问题分析 由于 ELISA 酶联免疫试验 具有灵敏度较高 特异性好的特点 已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如 肝炎 爱滋 优生优育等 虽然洗板只是 ELISA 实验重要环节中的一个 但作为专业的洗板机生产厂家 我们必须对影响 ELISA 实验结果各因素有一定的认识 优质的 试剂 良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件 如不注意 就易出现白板 花板 色弱和假阳性等现象 尤其是 花板现象 就是空白 阴性 阳性对照以及室内质控孔结果正常 而标本孔的 OD 值却明显偏高 是各个 厂家洗板机调试中经常遇到的问题 现将 ELISA 实验操作中注意事项总结如下 以期给大家带来一些启 发 以改善洗板机的安装调试水平 提高临床检测质量 1 标本及采集 贮运因素 严重溶血严重溶血 以 HRP 为标记的 ELISA 测定中 残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性 催化底物 显色造成假阳性 混有红细胞的血清混有红细胞的血清 易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净 如有 细菌污染细菌污染 菌体中可能 含有内源性 HRP 也会产生假阳性反应 标本凝固不全标本凝固不全 有时为了争取时间快速检测 常在血液还未开 始凝固时即强行离心分离血清 使血清中仍残留部分纤维蛋白原 在 ELISA 测定过程中可以形成肉眼可 见的纤维蛋白块 易造成假阳性结果 采血试管洗涤不彻底采血试管洗涤不彻底 反复使用易交叉污染 塑料试管能吸附抗塑料试管能吸附抗 原物质原物质 样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性 血清标本宜在新鲜时检测 严重溶血标本禁用 一般说来 在 5 天内测定的血清标本可放置于 4 标本在冰箱中保存时间过长导致血清 IgG 聚合 使间接法的 试剂 本底加深 超过一周测定的需 20 保 存 冻结血清融解后 蛋白质局部浓缩 分布不均 应充分混匀并避免产生气泡 混浊或有沉淀的血清标 本应先离心或过滤 澄清后再检测 反复冻融会使 抗体 效价跌落 所以测 抗体 的血清标本如需保存作多 次检测 宜少量分装冰存 最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管 并使用非抗凝标本 肝素抗凝血浆 会增加 OD 值 可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关 EDTA 酶抑制剂 如 NaN3 可抑制 ELISA 系统中辣根过氧化物酶活性 血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清 或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂 2 试剂的影响 ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡 由于历史的原因 人们往往以反应本底的好 坏来衡量 ELISA 反应 试剂 盒 因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包 被 该类 试剂 盒的流行病学敏感度不够 稳定性也成问题 也有厂家坚持 试剂 盒高的流行病学敏感度 科学地对待反应结果 基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟的优越性 就 HCV ELISA 试剂 盒来讲 第 一代产品为合成肽抗原 主要是 HCV 特异性抗原决定簇的肽片段 第二代产品包被的抗原既有基因工程 抗原又有合成肽 只是当时的基因工程抗原不全 仅包括了 HCV 的核心区片段 第三代产品基本上采用 了基因工程抗原 而且这些抗原包括更多 更稳定 纯度更高的 HCV 特异性抗原 第三代 试剂 的敏感 度大大提高了 基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原 多以大肠杆菌或 酵母 菌为表达 系统 该类抗原与合成肽相比具有以下特点 a 分子量大 合成肽采用化学方法制备 由于工艺的局限 合成数量有限 只能达到数百个氨基酸 而利 用基因工程制备的抗原 分子量更大 b 稳定性好 包被的抗原的稳定性可使 试剂 盒的效期得到保证 早期以合成肽为包被抗原的 试剂 盒效期 只有 3 4 个月 采用基因工程抗原后效期大大延长了 c 基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达 表达产物包含更多的抗原决定簇 可提高 试剂 盒的 灵敏度 提高检出率 d 纯化难度大 基因工程抗原的纯化技术难度较大 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段 合成肽抗原 有以下特点 a 分子量太小 b 一般只含有一个抗原决定簇 c 纯度高 d 稳定性差 国内乙肝两对半试剂厂家较多 不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别 资料显示 不同 厂家试剂的特异性和敏感性分别为 89 4 99 3 78 89 存在较大差异 有的厂家酶标板孔间 A 值 差大于 15 标记酶的活性及显色液的稳定比较差 使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性 因此 选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一 选择试剂时应选择灵敏度高 特异性好 稳定性好 批间差小 操作方便省时的优良检测试剂 国家参 比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果 可作为选择试剂的主要依据 要注意试剂的批号和出厂日期 虽然试剂的有效期多为 1 年 最好选择刚出厂的试剂使用 不同厂家的试剂不能混用 不同方法学的检测试剂 会使两对半结果出现一些不同 例如 在实际工作中常用 ELISA 检测 HBsAg 结果为阴性 而电化学发光检测为阳性 除方法学的灵敏度外 还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别 单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异 建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题 3 操作技术的影响 操作过程的控制 严格按照试剂说明书进行操作 操作前将试剂在室温下平衡 30 60min 加样后及时放人孵箱 标本较多时 要分批操作 按说明步骤严格控制操作时间 防止孵育时间人为 延长 导致非特异性结合紧附于反应孔周围 难以清洗彻底 3 封板温育时 各孔一定要封严 防止阳性标本的液体蒸发 产生周边现象从而导致 花板 的出现 4 用洗板机洗板时 保证洗液注满各孔 洗板针畅通 洗完板后最好在吸水纸 选择干净 无或少尘的吸 水材料 上轻轻拍干 还要防止针口有纤维蛋白或异物 这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致 花板 的出现 5 合理安排检测量 以免反应板过多造成洗板等待时间长 6 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干 7 显色剂尽量在临用前配制 坚持不用过期显色剂 肉眼可见浅蓝色的 TMB 显色剂不用 8 加样时保持显色剂不外流 A B 液应避免接触金属器械 加终止液时应避免产生气泡 9 应保证酶标板清洁 整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸 以上的措施可以使 花板 降至最低限度 从而提高检测的特异性 并得到更准确 可靠的实验结果 加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性 直接影响检测结果 由于吸嘴构造特殊 导致清洗困难 加大了 交叉污染的机会 建议用一次性吸嘴 加样器也要经常清洗 定期校准 加样时应将所加物加在 ELISA 板孔的底部 避免加在孔壁上部 并注意不可溅出 温浴影响 在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时 实验表明 两次抗原 抗体 反应一般在 37 经 1 2 小时 产物的生成可达顶峰 为避免蒸发 板上应加盖 也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔 反应板 不宜叠放 以保证各板的温度都能迅速平衡 应注意温育的温度和时间应按规定力求准确 由于公司的试 剂 盒温育是在空气浴中完成 采用水浴会造成值偏高或花板 另外温育中还有边缘效应 边上的值会偏 高 建议为了客观的判断结果 将质控放在非边缘位置 96 孔酶标板结构特别 易产生边缘效应 抗原 抗体结合及酶促反应对温度有严格要求 酶标板周围与内部孔升降温速率不同 造成周边与内部孔结果差 异 干浴与水浴存在明显的差异 尽可能使用水浴 并要求固相板放入水中 减少受热不均 贴密封膜 防止污物浸入 洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤 但却决定着实验的成败 ELSIA 就是靠洗涤来达到分离 游离的和结合的酶标记物的目的 通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质 以及 在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质 聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的 而在 洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来 可以说在 ELISA 操作中 洗涤是最主要的关键技术 应引起操作者的高度重视 操作者应严格按要求洗涤 不得马虎 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液 各种 试剂 盒的洗液不要混用 聚苯乙烯载体与蛋白质的 结合是疏水性的 非离子型洗涤剂既含疏水基团 也含亲水基团 其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水 键结合 从而削弱蛋白质与固相载体的结合 并借助于亲水基团和水分子的结合作用 使蛋白质回复到水 溶液状态 从而脱离固相载体 洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温 20 其浓度可在 0 05 0 2 之间 高于 0 2 时 可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度 洗液需要稀释 应按要求稀 释 配制洗液应用新鲜的和高质量的纯化水 电导率小于 1 5 s cm 洗液如果结晶应待其融解后配制 手洗条件一致性较差 对结果影响较大 防止洗液在孔内形成气泡 半自动与全自动冼板机使用不当也会 影响结果 血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态 造成 未结合标记酶洗脱不彻底 导致 花板 造成假阳性或假阴性 所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针 孔内洗液的通畅状况 及时纠正 洗板机不用时应用去离子水清冼几遍 保证洗板浸泡时间为 40 秒左右 孔内液体被洗板机吸得越干净洗涤效果更好 手工洗板 4 显色和比色 TMB 经 HRP 作用后 约 40 分钟显色达顶峰 随即逐渐减弱 至 2 小时后即可完全消退至无色 TMB 的终止液有多种 叠氮钠和十二烷基硫酸钠 SDS 等酶抑制剂均可使反应终止 这类终止剂尚能 使蓝色维持较长时间 12 24 小时 不褪 是目视判断的良好终止剂 此外 各类酸性终止液则会使蓝色 转变成黄色 此时可用特定的波长 450nm 测读吸光值 酶标比色仪简称酶标仪 通常指专用于测读 ELISA 结果吸光度的光度计 酶标仪的主要性能指标有 测读速度 读数的准确性 重复性 精确度和 可测范围 线性等等 优良的酶标仪的读数一般可精确到 0 001 准确性为 1 重复性达 0 5 酶标 仪不应安置在阳光或强光照射下 操作时室温宜在 15 30 使用前先预热仪器 15 30 分钟 测读结果 更稳定 测读 A 值时 要选用产物的敏感吸收峰 如 OPD 用 492nm 波长 有的酶标仪可用双波长式测读 即每孔先后测读两次 第一次在最适波长 W1 第二次在不敏感波长 W2 两次测定间不 移动 ELISA 板的位置 最终测得的 A 值为两者之差 W1 W2 双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印 等造成的光干扰 肉眼判断结果时 显色浅不易观察 影响结果的准确性 必须使用酶标仪检测 以保结果一致性 5 HooK 效应影响 随着 ELISA 一步法的应用 一些标本中抗原含量过高 产生 HooK 效应 影响检测结果 采用同步稀 释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减 HooK 反应的发生 6 干扰物质的影响 有人认为大约 40 的人血清标本中含有非特异性干扰物质 可以不同程度影响检测结果 常见的干扰 物质有 类风湿因子 补体 嗜异性抗体 嗜靶抗原自身抗体 医源性诱导的抗鼠 Ig s 抗体 交叉反应 物质和其它物质等 如 RF 因子可与标记二抗的 FC 段法结合造成假阳性 补体从 C1q 活化 使一抗和酶 标二抗的抗体分子发生变构 Fc 的 C1q 分子结合点暴露出来 则补体 C1q 可将二者连接起来造成假阳性 采用 56 30 分钟灭活补体可降低假阳性率 高浓度的 AFP 如孕妇 在储存过程中可能形成二聚体会 导致本底过深影响检测结果 7 药物的影响 高效价的乙肝免疫球蛋白会与 HBsAg 形成复合物 影响 HBsAg 的检出 所以一些 HBsAg 阳性患者 注射乙肝免疫球蛋白后 HBsAg 检测会呈阴性反应 导致乙肝两对半少见模式的出现 如我们常遇到乙 肝大三阳的孕妇 为阻断乙肝母婴垂直传播时 在孕第 8 9 10 月常规注射 200mg 乙肝免疫球蛋白 不仅影响孕妇 HBsAg 的检出 而且其所生产的生新儿也常出现 HBsAg 阴性 HBeAg 阳性和 HBcAb 阳 性等少见模式 可能是乙肝免疫球蛋白属 IgG 抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的 HBsAg 结合 形成复合物 则新生儿 HBsAg 检测呈阴性 用 0 5M 的盐酸处理标本 1 小时可提高出率 为预防乙肝 部分 HBsAg 阴性人群在接种乙肝疫苗后的 1 2 周内 血清中可检出 HBsAg 成份 形 成一过性 HBsAg 阳性 这可能是乙肝疫苗主要成分是 HBsAg 有方法能够把它检出 如电化学发光法 建议接种乙肝疫苗后 1 个月内不应作 HBsAg 检测 8 抗原自身因素 融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响 以丙肝诊断 试剂 盒为例为例 因为包被的基因工程抗原为融 合蛋白 包含了来自表达载体的一些序列可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本 少数 HBV 感染后外周血中不含 HbsAg HBV 感染后绝大多数感染者外周血中可出现 HBsAg 含量 在 5ng 600 g ml 之间 据文献报道 到目前为止在献血员中所发现的 HBsAg 携带者最低含量为 0 2 ng ml 含量高者可达 2000 g ml 以上 但有少部分 HBV 感染者血清 HBsAg 测定为阴性 如暴发性乙型 肝炎 HBV 的 S 基因发生变异等 急性重症乙型肝炎 肝细胞中以合成 HBcAg 为主 很少或不合成 HBsAg 从而使外周血中无 HBsAg HBV 的前 S S 基因编码 HBsAg 构成病毒外膜 根据所带亚型决 定簇的不同分为 adw adr ayw 和 ayr a 决定簇具有很高的免疫原性 在 HBV 的自然感染或注射 HBsAg 疫苗可引起抗 HBs 应答 如 S 基因 145 密码子变异使得其原来的甘氨酸被精氨酸替代时 可致 a 决定簇的抗原性发生改变 使机体产生的抗体对变异株无作用 且可引起 HBV 感染患者血清中同时出 现 HBsAg 和抗 HBs 同时乙肝疫苗接种也不能有效预防此类变异病毒的感染 乙型肝炎病毒 S 基因的变 异有自然变异和逃避免疫变异 变异可发生在多个部位 而且几处突变可同时存在 这些变异有助于病毒 携带状态的持续存在 近来 有研究表明 前 S1 区丢失突变 氨基酸 58 118 是引起 HBsAg 阴性的 HBV 感染的重要原因 S 启动子位于前 S1 是合成 HBsAg 的调节元件 前 S1 的丢失突变则会影响 S 启动子的功能 进而影响 HBsAg 的合成 总之 优质的 试剂 良好状态的仪器 排除各种影响因素的干扰和正确的操作是保证 ELISA 检测结果 准确可靠的必要条件 异常结果描述原因分析对策 试剂已过效期 或不同试剂盒组 分混用 检查试剂的组分及批号 确认未过期以及所有组分均 属对应的试剂盒 不同试剂盒或不同批号的试剂不能 混用 白板 显色步骤结 束后 酶标 板所有孔均 无颜色 阳 性对照不显 错加 漏加试剂底物 显色剂 A 或 B 严格按说明书的步骤操作 加完试剂后可观察一下液 面高度是否一致 以减少漏加现象 洗板及加样过程中 酶标受污染 失活失去催化显色剂显色的能力 确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等 确认配 制洗液的容器已洗干净 终止液误作洗涤液稀释或当底物 缓冲液配制 每次配制时都应看清标签标明物质 色 蒸馏水有问题 确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染 与好蒸馏 水比较 试剂盒超过期 超过有效期的产 品可能会产生很弱的信号 试剂 盒没有按规定进行保存 受高温 影响 实验前检查试剂的组分及批号 确认试剂未过期 不 要将试剂盒长时间置于常温下 按使用规定储藏 试剂 样品用前未平衡至室温 从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平衡 20 分 钟左右 加入试剂的体积和时间有误 移 液器计量不准 吸嘴内水分太多 或不清洁 确定所使用的试剂体积正确 加入时间适当 校正移 液器 移液器与吸嘴配合要紧密吻合 移液不宜太快 排放应完全 洗板及加样过程中 酶标受污染 失活而失去催化显色剂显色的能 力 确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等 确认配 制洗液的容器已洗干净 确认配制洗液的纯化水达到 要求且未受污染 孵育时间及孵育温度未达到要求 反应板放入培养箱时注意温度 并及时调整 孵育温度应控制在 37 38 孵育时间严格按照说明 书操作 保温期内不宜多开门 以免影响保温 洗板次数过多 或浓缩洗液稀释 倍数不符合要求 洗涤冲击力太 大 浸泡时间太长 严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板 减小洗涤冲 击力 按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数 显色剂加量不足或顺序颠倒 或 混合后加入 显色剂滴瓶垂直向下 持力均匀 滴速不宜过快 先 加显色剂 A 后加显色剂 B 不可将 A B 液混合后 加入 底物作用时间不够 准确定时 实验结束后 包括阳性对 照 质控在 内的所有板 孔颜色均较 淡 蒸馏水水质有问题 测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响 待测标本中可能不含强阳性标本 故结果可能是正常的 如有怀疑 可复检 实验结束后 阴阳性对照 正常 质控 正常 但临 床标本感觉 显色较弱 标本加入叠氮钠作为防腐剂 酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂 可选用 proclin 硫柳汞等其他防腐剂 未达要求的孵育温度及孵育时间 可检出强阳性标本 但 质控或弱 阳性标本受 温度变化影响较大而 被未检出 确认孵育的温度及孵育时间达到要求 质控品或标本高温放置过久 或 被反复冻融致待测物滴度下降 而未能检出 质控品或标本避免反复冻融 标本在一周内使用的 可存于 2 8 如需长期保存 应置于 20 以下保存 质控品应小量分装 并置于 20 以下保存 显色 弱 灵敏 度低 阴阳性对照 正常 但质 控 参考品 或个别弱阳 性标本未能 检出 仪器设定不正确 滤光片不匹配 重新设定酶标仪的参数 特别是检查滤光片是否匹配 终止后 目 测结果正常 但酶标仪读 值结果偏低 酶标仪参数设定不正确 重新设定酶标仪的参数 特别是检查滤光片是否匹配 整板的黄板现象可能是由于错加 其他试剂造成 如同时操作两对 半试剂时 测 HbsAb 板用于测 HBsAg 等 实验前检查试剂的组分及批号 确认所有组分均属于 对应的试剂盒 不同试剂盒或不同批号的试剂不能混 用 酶标对吸头的污染以及对盛放显 色剂容器的污染都易造成黄板现 象 避免试剂组分间的交叉污染 确保吸头 容器的干净 显色剂在光照条件下放置过久 实验前已变蓝 显色剂 A B 未使用前避光保存 孵育温度过高或孵育时间过长 孵育温度应控制在 37 38 孵育时间严格按照说明 书操作 未按要求洗板 特别是洗涤时每 孔未注满洗液 易造成花板黄板 现象 严格按说明书要求洗板 终止后 整 板结果显现 均一的黄色 或淡黄色 或阴阳性对 照 质控正 常 标本阴 性标本 OD 值