免疫酶技术

免疫酶技术Immunoenzyme technique,概述： 70年代初在免疫荧光技术基础上建立。 较IF、RIA(radioimmunoassay)更优 越 , 具有敏感、安全、稳定、易观察结果等优点,原理： 利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab反应特异性，同时又不影响酶的活性，结合在AgAb上的酶催化底物，生成有色产物，根据产物颜色深浅推测出待测物中相应物质（Ab、Ag)有无及含量多少。Ag + AbE AgAbE + 底物 呈色反应,免疫酶技术具有 特异性 Ag、Ab反应 敏感性 酶的高效催化作用,两种方法:,酶免疫组织化学染色技术（免疫组化）酶免疫测定法（酶联免疫吸附实验，Enzyme-Linked immunosorbent assay,ELISA),常用的酶（一）选择酶的要求1.自然界存在广，易获得2.易纯化、性稳、活力高3.形成的酶结合物稳定，并保留酶、 抗体或抗原的活性,4.底物来源方便并易保存5.反应后有色产物能快速测定6.酶分子量不能太大，太大不易进入组织细胞内，影响组化染色定位,（二）常用的酶辣根过氧化物酶碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶等,辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP)一种铁卟啉蛋白质，分子量4.4万，能进入细胞内酶活性强，酶结合物可长期保存最适pH为5.5左右,选用时注意酶纯度和活性纯度：RZ表示，反映酶含量与蛋白含量之比，最好要RZ值为3.0左右活性：每1mg酶中所具有的活性单位，应大于250u/mg,HRP的底物：邻苯二胺(OPD),四甲基联苯胺（TMB）反应体系中作为供氢体DH2+H2O2 D+2H2O供氢体 受氢体 有色产物,HRP,OPD特点： 有色产物为黄色 空白对照接近无色 敏感度高，有致癌作用TMB特点： 有色产物为蓝色 无致癌作用,底物系统（包括供氢体、 受氢体） 临用时配，配后避光保存,酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked immunosorbent assay） ELISA,一.原理： 将酶分子与Ab或Ag连接成一酶结合物（酶标记物），当它与固相载体中相应Ag或Ab相遇，形成酶标记的AgAb复合物，加入底物，酶催化底物，生成有色产物，根据颜色深浅可测出溶液中Ag或Ab的量。,固相载体,聚苯乙烯,Ag或Ab吸附到固相载体上的过程,称为包被,(酶免疫测定法),实验中所需酶标抗体的制备方法同荧光抗体制备：纯化后的抗体+酶 透析去除游离酶 测定酶标抗体工作浓度,试验中有关术语及试剂： 包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后，不能被洗脱。包被缓冲液：PH9.6 CB 洗涤(wash)：PH7.2-7.4 PBS 酶结合物 ：酶标抗体或酶标抗原 终止液：2M H2SO4,OPD：HRP催化后其有色产物为黄色，H2SO4终止后变为橙色（棕色）。TMB：HRP催化后其有色产物为蓝色， H2SO4终止后变为黄色,二.方法类型和操作步骤（一）双抗体夹心法,双抗体夹心法步骤：包被已知Ab 洗涤 加待测标本（测Ag？） 洗涤 加酶标Ab 洗涤 加底物 加终止液 观察结果,双抗体夹心法的基本实验过程,洗涤三次,终止液,该法主要用于检测抗原 包被的抗体与酶标抗体属同一种类抗体 每检测一种抗原就需制备相应的酶标抗体，较麻烦,（二）间接法测抗体,步骤：包被已知Ag待测标本（测Ab？） 反应一段时间后，洗涤加酶标抗抗体（酶标羊抗人IgG）洗涤加底物加终止液 ，观察结果。,该法主要用于测抗体 酶标记一种抗抗体可以用于多种抗 体的检测,包被抗体,加标本（抗原）,加抗体,加酶标抗抗体,间接法测抗原,（三）双位点一步法,步骤：包被抗体A待测标本 酶标抗体B 洗涤，底物终止液，观察结果（检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位）,该法是一次性加入标本和酶标抗体，试 验程序简单，提高了检测的特异性 用于检测Ag , 且Ag是具有至少2种抗原表 位的多价抗原反应系统中固相Ab与酶标Ab的量相对于待测Ag是过量的，因此复合物的形成量与待测Ag含量成正比（在方法可检测范围内）,（四）竞 争 法,步骤：待测管：已知Ab包被待测标本（Ag？） 洗涤，酶标Ag洗涤，底物显色,先加,先加,（五）应用亲和素和生物 素的ELISA,亲和素(avidin)：糖蛋白，一分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合 生物素(biotin)：维生素H，可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定,亲和素,生物素,生物素,生物素,生物素,亲和素 生物素在ELISA中使用：,三.ELISA结果的判定（一）肉眼判定 与阳性、阴性对照颜色比较：,结果判定,2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判 定为阳性；,3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性。,1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性；,（二）酶标光度仪检测A492值 （吸光率）：比色法1.与阳性、阴性对照测定值比较2.P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0 为阴性 P: positive（待测吸光度值） N: negative,四.ELISA试验的影响因素（一）固相载体 常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸附Ag或Ab的能力强，一但吸附后，不能被洗脱。 固相载体：酶标板 可分软、硬板 一次性使用，不可回收,酶标板要求：吸附性能好、空白值低、透明度高板批间、孔间性能相近,（二）抗原、抗体Ag：需纯化Ab：需效价高、亲和力强、纯化,（三）试验条件1.包被： 一般用pH 9.6 CB(carbonate buffer)，0.05M, 有利于蛋白质吸附,包被浓度：0.1100g/ml，一般常用10 g/ml包被时间、温度：4 过夜或37 1-3h包被量：100ul封闭：用0.15% 牛血清白蛋白缓冲液浸泡 0.5小时,2.抗原抗体反应的条件（1）微碱性有利于抗原抗体结合，故用pH 7.4 PBS(phosphate buffer saline)洗涤（2）去污剂有利于AgAb形成，洗液中加0.05% Tween-20（3）Ag、Ab反应时间、温度： 一般 37、3040min,3.洗涤 采用 PH7.2-7.4PBS洗涤，规一化，每次浸泡12min，拍干，共洗涤34次,4.酶促反应条件 温度 37 时间 10min pH 5.5 底物量 一致,5.排除干扰：多设 对 照,ELISA试验应设对照应设对照 操 作 应得结果阳性对照 同标本一样 颜色深 阴性对照 同标本一样 颜色浅or无色酶结合物对照 加酶步加入 无色底物 对照 加底物步加入 无色空白对照 只加终止液 无色,（以间接法为例，每孔均已包被Ag）,血清 100ul 酶标二抗100ul 底物100ul 终止液100ul待测 待测标本 血清 + + +阳性 阳性对照 血清 + + +阴性 阴性对照 血清 + + +酶结合物对照 PBS100ul + + +底物对照 PBS100ul PBS100ul + +空白对照 PBS100ul PBS100ul PBS100ul +,五.ELISA试验优缺点优点:1.既可测抗原又可测抗体2.微量、定性、定量3.特异性、敏感性高4.操作简单,可不用特殊仪器,缺点:1.影响因素多,多方把关2.偶有假阳性、假阴性,六.膜载体的酶免疫测定,（一） 斑点-ELISA,特点:1. 固相载体为硝酸纤维素膜2.酶促反应后在膜上形成有色沉淀物,固相Ag,（二）免疫印迹法(immunoblotting test,IBT),七. 应 用(包括所有标记技术),(一)病原体的诊断及研究1.病毒、细菌等传染病的诊断 (测抗原或抗体)2.病毒、细菌表面抗原的研究,(二)某些疾病的诊断1.某些微量物质有关疾病的诊断2.肿瘤的诊断及定位3.自身抗体检测协助自身免疫病诊断4.寄生虫疾病的诊断等,(三)免疫学方面的研究 T、B 细胞的发生、演化、 表面 抗原改变等的研究,(四)微量物质的检测 体内:微量蛋白质、激素、酶 等抗原;药物、糖等半抗原 工农业:微生物、微量物质等,思考题：1.ELISA 的原理、方法（以间接法测抗体和双抗夹心法为例）及影响因素。2. ELISA试验应设哪些对照，为什么？3.判断ELISA试验结果的方法。,发光免疫技术,发光免疫技术是将发光系统与免疫反应相结合，来检测抗原、或抗体的方法。,化学发光免疫测定一.化学发光酶免疫测定（chemiluminescent enzyme munoassay，CLEIA) 试验前部分与ELISA一样，改变所加底物，使产物能发光，用仪器检测发光强度，判断结果。,如酶是用辣根过氧化物酶，常用底物是鲁米诺或其衍生物。,二.化学发光标记免疫测定（chemiluminescent munoassay，CLIA) 是用化学发光剂作为标记物直接标记抗原或抗体的免疫测定方法。,金免疫技术 采用胶体金作为标记物,胶体金又称金溶胶，是金盐(氯金酸）被还原（还原剂：柠檬酸钠）成原子金后形成的金颗粒悬液,胶体金的特性：1.胶体金性质：颗粒稳定均匀，分散悬浮，1100nm2.呈色性：颜色与颗粒大小有关 25nm 橙黄色 1020nm 酒红色 3080nm 紫红色,一.斑点金免疫渗滤试验（dot immunogold filtration assay，DIGFA)原理：采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为载体，使抗原抗体反应和洗涤在同一渗滤膜上，反应后根据在膜中央形成的红色斑点（胶体金聚集）有无来判断结果。技术类型：双抗体夹心法（测Ag)； 间接法(测Ab),二.斑点免疫层析试验（dot immunochromatographic assay，DICA) 以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析,1:鼠抗人H