大蓟总黄酮诱导肿瘤细胞凋亡作用的研究

1 / 5大蓟总黄酮诱导肿瘤细胞凋亡作用的研究作者：刘素君，郭红，潘明，杨志荣，张杰【摘要】目的研究大蓟总黄酮对肿瘤细胞凋亡的影响。方法用不同浓度的大蓟总黄酮对人肝癌 SMMC-7721 和人子宫癌细胞 Hela 进行处理，MTT 法检测细胞活性，再用琼脂糖凝胶电泳观察 DNA“梯子”(Ladder)和 DAPI 染色观察凋亡小体。结果大蓟总黄酮对 SMMC-7721 的半数致死量(IC50)为 g/ml；对 Hela 细胞的半数致死量(IC50)为 2 g/ml。可见清晰的“梯子”状 DNA 带纹和凋亡小体。结论大蓟总黄酮能诱导癌细胞的凋亡，从而达到抗肿瘤的作用。 【关键词】 大蓟总黄酮抗肿瘤细胞凋亡大蓟为菊科管状花亚科菜蓟族蓟属植物 Cirsium japonicum DC. 的干燥地上部分或根1 ，多年生草本，高 100150 cm，茎直立，密被白毛，叶互生；叶片倒卵状长椭圆形，边缘具浅裂和斜刺，被毛；56 月开花，头状花序顶生，花单生，紫红色，瘦果扁椭圆形，生于山野路边，以全草和根入药，我国大部分地区有分布。全草灰绿色，大蓟性凉，味甘、苦,归心、肝经，功效为凉血止血、祛瘀止痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、带下、肠风、肠痈、痈疡肿毒、疔疮、高血压及肝炎等。其化学2 / 5成分复杂，主要含有黄酮、黄酮苷，挥发油、三萜和甾醇等物质。大蓟在民间验方多用于治疗癌症，如：大蓟根、三白草根治肝癌；鲜大蓟叶与鸡蛋清搅拌后贴于患处，可治乳腺癌等。大蓟的主要成分为黄酮类化合物，文献报道其多聚乙炔具有抗肿瘤作用2 。其总黄酮在体内有抗肿瘤作用并能提高肿瘤小鼠的免疫功能3 。但总黄酮对肿瘤细胞诱导凋亡的作用还没有研究，就其对肿瘤细胞诱导凋亡的作用进行初步探索。1 材料与仪器瘤株 SMMC-7721 和 Hela 细胞株，购自上海细胞生物学研究所。药物：大蓟由成都中药材公司提供。试剂 RPMI 1640 培养基、胎牛血清(FBS)为 GIBCO公司产品，染料碘化丙啶(PI)、胰蛋白酶均为 Sigma 公司产品，四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自上海普飞生物技术有限公司。仪器酶标仪，离心机，倒置显微镜。大蓟总黄酮的制备大蓟总黄酮由本室制备。将大蓟70%乙醇提取物与硅藻土拌样挥干后,装入玻璃管柱中,用石油醚流洗,去除其中的叶绿素和极性较小的成分;流洗结束后倒出硅藻土化合物,挥干溶剂重新装入玻璃管柱,正丁醇流洗提取,用 1%三氯化铝乙醇溶液与黄酮类化合物在滤纸上显色后，在紫外灯下观察有无黄绿色荧光的方法检测监控,3 / 5提取至流洗液无黄酮反应时结束;将正丁醇提取液浓缩后挥干溶剂,用少量 95%的乙醇溶解后上聚酰胺树脂柱,依次用水和 95%的乙醇洗脱,收集 95%的乙醇洗脱液,洗脱至检测无黄酮反应时结束;浓缩 95%的乙醇洗脱液,自然干燥,挥干溶剂后得到的成分即为总黄酮成分。紫外分光光度测定其总黄酮为%。总黄酮用 DMSO 溶解。2 方法MTT 法检测药物对肿瘤细胞增殖的作用 SMMC-7721和 Hela 细胞株用%胰蛋白酶化后，悬浮于含 5%小牛血清的RPMI1640 培养液中，用玻璃滴管轻轻吹打成单细胞悬液。取少许细胞悬液于血细胞计数板计数，活细胞数大 97%，将细胞株悬液接种于 96 孔培养板,每孔 190 l(含 1 104个细胞),24 h 后，分别加入阴性对照磷酸盐缓冲液(PBS)、阳性对照以及200 g /mg 不同浓度的大蓟黄酮提取液各10 l,3 复孔，置于饱和湿度、37、5%CO2 培养箱中培养 72 h,然后每孔加入 10 l 5 mg/ml 的 MTT 溶液继续培养 4 h，仔细吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜 150 l。1 h 后，在 570 nm 波长处用酶标仪测 OD 值。重复 3次并计算抑制率。抑制率(IC)=(对照组 OD 值-实验组 OD 值)/对照组 OD 值 100%。 DAPI 染色的染色体 DNA 的形态分别收集大蓟总黄酮4 / 5处理细胞和未用药的细胞用定色剂染色 10 min，10 min 后用 PBS 冲洗，细胞再用 DAPI 液，然后用固定液固定，染色体 DNA 的形态在荧光显微镜下观察。23 DNA 琼脂糖凝胶电泳分别收集大蓟总黄酮和顺铂处理细胞 1105 个，按酚、氯仿、异戊醇抽提，乙醇沉淀等常规方法提取细胞总 DNA，2琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪上观察 DNA 条带。3 结果MTT 法测试结果用剂量200 g /mg 的大蓟总黄酮处理 SMMC-7721 和 Hela 细胞 48h 后，MTT 法测定大蓟黄酮对癌细胞的抑制作用。从图 1 可以看到，对 SMMC-7721和 Hela 细胞的 IC50 分别为 g/ml 和 g/ml，同空白对照组比较差异极显著。当用剂量200 g /mg 的大蓟黄酮处理 SMMC-7721 和 Hela 细胞 1，2 d 或 3 d 后，对肿瘤细胞的生长，从图 2 可以看到，活细胞数随着大蓟黄酮浓度的增加而减少。研究结果表明大蓟黄酮对 SMMC-7721 和Hela 细胞的抑制呈剂量和时间依赖性。用大蓟黄酮处理时间越长或剂量越大，对肿瘤细胞的抑制效果就越明显。琼脂糖凝胶电泳结果琼脂糖凝胶电泳结果见图 3，从 DNA 电泳图上可以看到，癌细胞经 100 l/ml 的大蓟总黄酮处理培养 72h 后，出现大小约为 180200 bp 整数倍的 DNA 梯形断裂条带，而空白对照组细胞 DNA 提取物经琼5 / 5脂糖凝胶电泳后只检测到一条总 DNA 条带。Hela 细胞用100 l/ml 的大蓟黄酮处理培养 72h 后，出现大小约为180200 bp 整数倍的 DNA 梯形断裂条带(图