高效液相色谱法应用中常见问题与处理

1 高效液相色谱法应用中常见问题与处理 lionguy 呼和浩特 010010 摘 要 对高效液相色谱法应用过程中常见的问题及其处理方法进行了阐述 关键词 液相色谱法 问题及处理 1 对流动相的要求对流动相的要求 1 1 应使用色谱纯的液体试剂配制流动相 固体试剂至少使用优级纯 流动相配制后应立即 使用 时间久了 超过 2 天 不宜再用 特别是加有缓冲盐的流动相 过久的贮存会导致其 内部生长肉眼看不见的细菌 若仍然使用它 大量的菌丝体就会附着在色谱柱内 将大大 缩短色谱柱的使用寿命 1 2 高纯水也应该使用新鲜制备的 否则回出现与 1 1 同样的问题 高纯水是将饮用水经过 二次处理 其中至少一次是蒸馏 的水 高纯水中若含有极微量的无机离子杂质 就好像流动 相中含有的缓冲盐一样 通常对检测结果不产生不良影响 高纯水中若存在有机物杂质 当时对检测好像也没有什么影响 当日积月累的杂质吸附达到饱和时 在以后某次检测中 就有可能发生吸附杂质的脱落 引起 鬼峰 现象 如果 鬼峰 叠加到了组分的吸收峰 上面 就会出现不准确的检测数据 1 3 当使用酸性的缓冲盐流动相时 在 pH 为 7 左右时 首选磷酸盐缓冲溶液作为流动相 因其缓冲范围是 pH 6 1 8 1 其次可选择醋酸盐缓冲溶液作为流动相 其缓冲范围是 pH 3 8 5 8 当样品的检测波长在 210nm 附近时 不可使用含有醋酸或柠檬酸的缓冲液做 流动相 因其本身在 210nm 波长处具有一定的吸收 1 1 4 当检测的样品比较多时 所使用的流动相应一次性足量配制完成 避免在检测过程中由 于添加流动相 而造成被测组分峰面积的变化及保留时间的漂移 1 5 流动相在使用前均应进行脱气处理 避免溶解在其中的气体影响基线的稳定性和检测的 灵敏度 2 流路中流动相的存放流路中流动相的存放 2 1 如果当天使用的是甲醇 水混合流动相系统 而且 次日仍然使用该流动相系统 检测 结束后用该流动相继续冲洗色谱柱后 就可以关机 2 2 如果在反相色谱法中使用了其他有机流动相或者是使用了加有缓冲盐的流动相 检测结 束后应该首先用适当的溶剂清洗色谱系统 溶剂的选择 置换与混合请参考下表 不可互相置换的溶剂组可能发生的问题应采取的措施 水与低极性溶剂 正己烷 氯仿等 乳浊 分层先用异丙醇或丙酮置换 缓冲溶液与有机溶剂 甲醇 乙腈 四氢呋喃 析出沉淀先用水置换 稀硝酸和乙醇发生反应先用水置换 各个通道用所选择的溶剂冲洗干净后 每个通道冲洗 20 30 分钟 柱压高时需要增加冲洗 时间 最后再用甲醇冲洗 洗净后 柱压很稳定时 就可以关机 2 3 仪器长时间不使用时 若使用过正相色谱法 色谱流路中用正己烷保持 若使用过反相 色谱法 一定要在各个流路中用甲醇保持 切忌在流路中长时间存在乙腈或高纯水 有乙 腈存在的流路中 乙腈会对比例阀中单向球阀的橡胶衬垫产生溶涨作用 致使其黏性增大 并吸附流动相中微量的纤维丝等异物 久而久之会造成单向阀密封垫的不严密 引起比例 阀不能够按照设定的比例对各流路通道的流动相进行混合 由此导致基线的波动 同理 也不能用高浓度 85 以上 的乙腈做流动相 例如 当使用 25 的乙腈和 75 的缓冲盐 混合溶液作为流动相时 应将两者混匀后再使用 切忌在两个流路通道上利用比例阀来进 行混合调配 否则 也会发生上述现象 高纯水在流路中长时间存在时 会引发细菌的生 长 2 3 色谱柱的使用与保护色谱柱的使用与保护 2 3 1 安装色谱柱时 注意色谱柱的标示箭头方向应与流动相的流向一致 3 2 新购进的色谱柱不宜直接使用 应该在断开色谱柱与检测器的连接 用适宜的溶剂充分 冲洗并使冲洗液直接流入废液瓶 洗净后再与检测器连接和使用 用同样的方法可以冲洗 被污染的色谱柱 被污染的反相色谱柱用一般的溶剂冲洗不净时 可用含 THF 的溶剂进行 冲洗 被蛋白质类污染的色谱柱用一般的溶剂冲洗不净时 可用含 DMSO 的溶剂进行冲洗 3 3 在使用色谱柱之前 要仔细阅读色谱柱的说明书 使用时柱压不可以太高 通常柱压不 超过最高允许柱压的 4 5 柱压过高时 会引起色谱柱内部填充物的塌陷 造成死体积 在 以后的检测中会经常出现色谱峰的分叉现象 在实际工作中 当柱压过高时 应及时关闭输液泵并检查是否柱头发生堵塞 必要时 更换预柱的滤芯 也可以采用降低流速或改变流动相比例等方法进行处理 若压力显示过 低或压力波动无法进行分析时 应检查各流路中的气泡是否已经全部排除 各连接处有无 漏液 purge 阀是否已经关闭等 排除故障后方可继续操作 3 4 要注意色谱柱的使用温度 对于十八烷基键合硅胶色谱柱而言 使用温度不得超过 60 温度过高时 会引起十八烷基碳链的断裂而损坏色谱柱 3 5 要注意色谱柱使用的 pH 值范围 硅胶是聚合态的硅酸 它在酸性条件下比较稳定 十 八烷基键合硅胶色谱柱应该在 2 7 5 的 pH 值范围内使用 在碱性条件下 构成硅胶的硅 酸单体会发生溶解 生成硅酸盐 而流失 导致色谱柱的损坏 3 6 使用液相色谱仪测定样品时 待测样品溶液在进样前必须用 0 45 m 的滤膜过滤 否则 其中的固体或大分子杂质很容易堵塞色谱柱 另外 在色谱柱之前还应该加一个预柱 以 保护色谱柱 并经常更换预柱芯 特别是检测药物残留或进行药物代谢动力学研究时 样 品是经过处理的动物组织 血液或尿液 其中含有蛋白质大分子 更应该小心 3 7 分析结束后应及时清洗色谱柱 正相色谱柱用甲醇 氯仿 1 1 乙酸乙酯冲洗 正 己烷保持 反相色谱柱参考 2 2 进行处理 甲醇保持 3 8 每间隔 3 个月 断开色谱柱的连接 用 60 的高纯水 在 purge 状态下 对各个管路进行 高速冲洗 以达到清除吸附的杂质和养护前段流路的目的 对于检测器部分的流路可用 10 稀 硝酸进行冲洗 冲洗干净后 按 3 7 进行保持 4 脱尾现象的原因及解决的方法脱尾现象的原因及解决的方法 4 1 检查柱效 可以按照该色谱柱说明书中介绍的方法进行验证 如利用取代蒽 苯酚 水 杨酸等标准品溶液进行试验 3 如果并不拖尾 说明该色谱柱的柱效没有问题 应寻找其 他原因 如果标准品也发生严重的拖尾 那就是柱子本身的问题了 若柱子已经吸附了大 量的杂质 它运行时柱压会很高 若通过洗脱及再生的方法都不能够使之恢复 那就只能 淘汰 4 2 检查流动相是否存在问题 在色谱柱中的硅胶表面 每平方纳米有 6 个硅醇基可供化学 键合 但由于 C18烷基键合基团空间位阻的存在 使得这些硅醇基不能全部参加化学键合 反应 2 例如 Partisil 5 ODS octadecylsilane 色谱柱 未被 C18烷基键合的硅醇基空位占 2 此时该柱以分配色谱占主导 Partisil 10 ODS 色谱柱 未被 C18烷基键合的硅醇基空位占 50 此时该柱既有吸附色谱又有分配色谱 当色谱柱填充料中存在少量未被 C18烷基键合的硅 醇基空位时 也容易出现拖尾 此时若是检测的药品带有碱性基团 请在 1000ml 流动相中 加入 0 7ml 左右的三乙胺或三乙醇胺 它可以键合这些空位 而起到扫尾作用 若是检测 的药品带有酸性基团 请在 1000ml 流动相中加入接近 1ml 的醋酸 它也能够起到相同的作 用 4 3 若样品中的杂质峰和被测定组分的峰没有完全分开 也有可能被误认为是拖尾 此时 3 可利用改变柱长 改变流动相的组成比例或提高柱温 不得高于 60 等方法解决此问题 5 色谱柱的再生色谱柱的再生 3 对于堵塞或吸附杂质较为严重的色谱柱 可以进行再生处理 方法是 5 1 反相色谱柱 流动相极性大于固定相极性 以甲醇 水 95 5 体积比 纯甲醇及 一氯甲烷等为流动相 依次冲洗 顺序不得颠倒 每种流动相的冲洗体积应 20 倍于柱体积 然后 再以相反的顺序依次冲洗 5 2 正向色谱柱 流动相极性小于固定相极性 以严格脱水的正己烷 异丙醇 一氯甲烷 及甲醇为流动相