纳米生物技术

第三部分 纳米生物技术,主要内容,3.1、纳米技术概述3.2、纳米粒子标记和检测技术3.3、纳米技术与生物医学（纳米药物载体）3.4、纳米安全性,3.1、纳米技术概述,纳米（Nanometer，nm）1 nm=10-9 m纳米结构（Nanostructure）至少有一维尺寸在100 nm以下的微小结构,如果把一粒纳米材料放在乒乓球上，就好像把一个乒乓球放在地球上一样,1-100nm,1km=1000m=100000cm=1000000000000nm,12738km,5cm,红血球直径：6-8m 细菌：200-600 nm 病毒：61-101 nm10个氢原子一个挨一个排成一列：1nm,纳米技术（Nanotechnology）是指在纳米尺度空间内操纵原子和分子，对材料进行加工，制造具有特定功能的产品或对物质及其结构进行研究，并掌握其原子、分子运动规律和特性的一门综合性的技术体系。纳米尺度空间为0.1100 nm,纳米材料的特性基本物理效应,表面（界面）效应小尺寸效应量子尺寸效应宏观量子隧道效应,粒子的大小与表面原子数的关系,*假如原子间距为0.3 nm，表面原子仅占一层，粗略地估算表面原子所占的百分比见上表。,表面（界面）效应：比表面大、表面原子的百分数剧增,体积效应（小尺寸效应、量子尺寸效应）：光、电、磁、化学特性和体材料相比发生很大变化等离子体共振频率随颗粒尺寸变化（宽频微波吸收材料）磁性变化：纳米磁性材料表现为超顺磁性电阻率发生突变：金属变成非导体，电阻温度系数发生变化,“纳米技术”和“纳米粒技术”,纳米技术强调从纳米水平生产构件和组合；纳米技术的构件和组合具备特殊的性质。纳米技术是“由小到大”的智能化技术。,“纳米粒技术”限于表面大小和尺寸的变化；物质性质的变化只与表面积和大小相关。“纳米粒技术”是“由大到小”的制备技术。,纳米生物技术 (Nanobiotechnology),生物技术（Biotechnology）是应用生物体（包括微生物、动物细胞、植物细胞）或其组成部分（细胞器和酶），在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术。现代生物技术主要包括：基因工程、细胞工程、酶工程，此外还有发酵工程、生化工程、蛋白质工程、 抗体工程等。,纳米生物技术 (Nanobiotechnology),纳米结构是生命现象中基本的东西蛋白质、DNA、RNA、病毒，都在1100 nm的范围光合作用在“纳米车间” 进行细胞中的一些结构单元都是执行某种功能的“纳米机械”，细胞象一个“纳米工厂”,纳米生物技术 (Nanobiotechnology),纳米生物技术是指用于研究生命现象的纳米技术，利用分子层次（纳米级）的有机或无机物操控技术，来解决目前生物学的问题。其目的并不只是将产品微小化，同时也希望通过控制分子的行为，达到控制组织与细胞的目的，并有效掌握控制纳米材料或复合物本身的多变性，以及与生物系统之间的交互反应。,利用新兴的纳米技术来解决和研究生物学问题；利用生物大分子制造分子器件，模仿和制造类似生物大分子的分子机器。,纳米生物技术的研究范围,纳米生物材料药物和转基因纳米载体纳米生物相容性人工器官纳米生物传感器和成像技术利用SEM分析蛋白质和DNA的结构和功能,以疾病的早期诊断和提高疗效为目标,3.2、纳米粒子标记和检测技术,生物传感器,荧光,纳米,生物分子 电解质离子 溶解气体 温度,signal,灵敏度高无损伤响应速度快二维平面成像,生物材料的大小： 细胞： 100 -10 um 细胞器：10 -1 um,活体线粒体中NADH的多光子成像。Karl Kasischke, et al. , Cornell University.,测量细胞中Ca2+浓度。Tsien, R.Y. et al. Science 280, 19541955 (1998).,无内源荧光,有内源荧光,生物检测对象,直接测定,引入荧光探针,1）半导体纳米粒子（量子点）标记物半导体纳米粒子也称为半导体纳米微晶粒（nanocrystal, NC）或量子点（quantumn dots, QD）II VI 族、III V 族粒径220 nm荧光量子点是在受到光激发或加上电压后会产生强的荧光发射的一类纳米材料。应用：平面显示器件、光电子元件、量子点激光器、生物标记物等,What are quantum dots,Unique Spectral propertiesBroad absorptionNarrow emissionWavelength depends on size一元激发、多元发射Hydrophobic crystals,（c）三种不同尺寸的量 子点的荧光光谱,量子点的荧光光谱,（a）荧光素的激发谱和发射谱（b）CdSe量子点的激发谱和发射谱,斯托克斯位移,CdS溶胶颗粒在不同尺寸下的紫外吸收光谱,由图看出，随着微粒尺寸的变小而有明显的蓝移,量子点的荧光优越性（与传统有机染料相比）,激发光波长范围宽, 发射光谱狭窄对称（FWHM 40 nm）且具有较大的斯托克位移(Stocks shift), 这样就允许同时使用不同光谱特征的量子点, 而发射光谱不出现交叠, 或只有很少交叠, 使标记生物分子荧光谱的区分、识别变得很容易。量子点可以耐受更长的光激励和光发射周期（可持续几小时），染料荧光分子的周期通常是几分钟，连续的激发将使荧光分子发生光化学分解，即光漂白（Photobleaching）。,量子点在生物学研究中的应用,如通过标记蛋白质、DNA等跟踪探测细胞和组织内生物分子的相互作用、信号传导、细胞器定位等；药物筛选；医学成像等。,尽管在性质上荧光纳米晶要远远优于传统生物标记物，但要想真正替代现有的标记物，尤其是有机染料，还面临一些必须解决的问题。高质量荧光纳米晶的大规模合成问题；纳米晶的水溶性问题；需要建立一套纳米晶与生物分子偶联的方法，由于纳米晶的表面性质对其荧光影响较大，所以偶联过程必须保证纳米晶的表面不被破坏。,Making hydrophobic quantum dots bio-compatible,Various methods for making them water-solubleDerivatizing surface with mercaptoacetic acidEncapsulating in phospholipid micellesDerivatizing surface with DHLACoating them with amine-modified polyacrylic acid,量子点标记过程示意,Conjugating quantum dots to biomolecules,Avidin or protein-G with positively charged tail conjugated to negatively charged DHLA coat of quantum dots,二巯基辛酸（DHLA）,Dihydrolipoic acid (DHLA)Maltose binding protein (MBP)Avidin 抗生物素蛋白,典型的QD生物标记示意图,细胞内部染色细胞内部染色对用光学显微镜和电子显微镜研究细胞内各种组织是十分重要的一项技术。未加染色的细胞衬度很底，目前有几种染色技术，如荧光抗体法、铁蛋白抗体法和过氧化物酶染色法等，目的是提高用光学显微镜和电子显微镜观察细胞组织的衬度。随着细胞学研究的发展，要求进一步提高观察细胞内组织的分辨率，这就需要寻找新的染色方法。纳米微粒的出现，为建立新的染色技术提供了新的途径。,用量子点检测肿瘤细胞,总的来说，由于量子点技术有其独特的标记特点，它必将成为今后生物分子检测的尖端技术，为DNA 检测(DNA 芯片) 、蛋白质检测(蛋白质芯片) 和探索蛋白质蛋白质之间(抗原抗体、配体受体、酶底物) 反应原理提供更先进的方法。同时也将极大的推动生物显像技术和生物制药技术的迅猛发展，给疾病的诊断和治疗带来巨大进步。,2）复合纳米粒子标记物,复合型纳米粒子是指荧光分子或发光分子通过高分子材料的包裹或连接形成几百个甚至上千个发光粒子构成的纳米粒子，如包裹着若干个染料分子的荧光纳米球，包含着稀土螯合物的纳米粒子。信号放大可克服外界环境对发光试剂的影响（如淬灭作用），增加发光试剂的稳定性已用于标记DNA结合蛋白探测DNA分子中的特异序列，超灵敏的测定前列腺特异抗原,荧光分子易被细胞内某种细胞器封存，或与胞内成分发生非特异结合，造成荧光信号失真稳定性差，存在荧光漂白单一的荧光波长,受探针浓度分布、光电子系统的随机漂移影响为适应自由进出细胞膜，分子结构需特殊的功能化,荧光探针分子,基质具有保护作用，防止了荧光分子与细胞内成分发生作用，同时提高了稳定性提高了荧光强度（大量荧光分子封装于一个颗粒中），即高信噪比；同时封装两种以上荧光分子，实现比率荧光传感多种成熟进入细胞方法：基因枪、皮量注射枪、细胞内吞作用,Hydrophilic Fluorescent Nanogel Thermometer for Intracellular Thermometry，C. Gota et al.， J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 2766.,Temperature-sensitive PolymerWater-sensitive Fluorophore,1. 荧光温度纳米传感器,纳米温度传感器的横截面示意图。温度探针分子Eu-DT随机分布于纳米颗粒内部（由BTD-PMMA组成） ，纳米颗粒表面覆盖着完整（或间断的）二氧化硅薄层。,Luminescent europium(III) nanoparticles for sensing and imaging of temperature in the physiological range. Peng Hongshang et al., Adv. Mater. 2010, 22: 716.,有机硅氧烷BTD：碱性环境下，硅氧烷基团迅速水解，以及硅醇缩聚，在纳米颗粒表面生成带负电二氧化硅薄层,聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）：减少温度探针的掺杂浓度，从而降低浓度猝灭以获得较强的发光和较长的荧光寿命。PMMA的折射率(1.49)与二氧化硅(1.46)匹配，这也使得生成的纳米颗粒拥有较好的光学透明度。,Eu-DT荧光特性：大的斯托克斯位移(200-300 nm) 针状发射峰 5D0发射具有强的温度依赖特性 可见光激发,荧光温度探针分子铕-三（二萘甲酰甲烷)-二(三辛基氧化磷) （Eu-DT）,温度纳米传感器的制备及表征,再沉淀-封装方法制备纳米颗粒示意图,Eu-DT掺杂浓度对纳米颗粒荧光强度和寿命的影响,根据温度敏感度的定义I /(IrefT), 纳米颗粒在生理温度范围内（25-45 oC）的敏感度为-3.07%/oC。假设荧光强度测量的精确度为1%，那么Eu-DT纳米传感器的温度分辨率可以达到 0.3 oC。,荧光纳米传感器的温度依赖特性之荧光强度,25-45oC之间，荧光寿命温度敏感度为-2.2%/oC。,荧光纳米传感器的温度依赖特性之荧光寿命,基于Eu-DT纳米颗粒的生物温敏薄膜的荧光成像,Eu-DT纳米颗粒置入生物相容性薄膜聚乙烯醇中。不同温度、不同压力下的荧光寿命伪彩色成像。蓝色相应于最长寿命（400 s），红色对应于最短寿命（122 s）。,Ratiometric fluorescent nanoparticles for sensing temperature, Peng Hongshang et al., J. Nanopart. Res. 2010, DOI: 10.1007/s11051-010-0046-8.,比率荧光纳米传感器的荧光强度的温度依赖特性,根据温度敏感度的定义，纳米颗粒的比率荧光强度在生理温度范围内（25-45 oC）的敏感度为-4 %/oC,Honghao Sun，et al., Chem. Mater., 2006, 18 (15), 3381,Preston T. S. et al., J. Am. Chem. Soc., 2006, 128 (41), 13320,Hilderbrand S. A. et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19 (8), 1635,2. 比率荧光pH纳米水凝胶,纳米水凝胶的截面示意图及组成成分化学结构式。在聚亚胺酯水凝胶中，溴百里酚兰，香豆素6和尼罗红随机分布。,Nanogel for Ratiometric Fluorescent Sensing of Physiological pH Values. Hongshang Peng et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49: 4246-4249.,聚亚胺酯（PU）：基质 溴百里酚兰（BTB）：pH指示剂， pKa=7.6 香豆素6（C6)：绿色荧光分子 尼罗红（NR）：红色荧光分子,PU:良好的亲水性和生物亲和性，不发光BTB: 不发光,比率荧光pH纳米水凝胶的制备及表征,再沉淀法：将PU, BTB, C6 和NR按照一定比例溶于乙醇/水（9/1）的混合溶液中，然后于水中透析24小时，经200nm的膜过滤，即得到水凝胶分散液,纳米水凝胶在水溶液中的粒径分布,比率荧光纳米水凝胶的pH传感机理,比率荧光纳米水凝胶的pH响应特性,比率荧光纳米水凝胶的pH校正曲线。实验数据由620nm 和500nm处的荧光强度比计算得到，拟合方程为,450 nm激发下，荧光纳米水凝胶在不同pH值（4.92, 5.29, 5.91, 6.24, 6.47, 6.64, 6.81, 6.98, 7.38, 7.73, 8.04, 8.34, 8.67, and 9.18）下的荧光发射光谱,在505 nm和620 nm处的荧光强度变化分别为+8% 和-8%，说明微量荧光分子的泄露。,比率荧光纳米水凝胶一个月后的稳定性,C,A,B,负载纳米水凝胶的小老鼠正常肾上皮细胞（pH 7.4）的荧光显微照片：绿色通道（A）、红色通道（B）以及混合通道（C）。图中标尺为20微米。利用干涉滤光片， C6用470 nm光激发，收集525 nm发射光。NR用 545 nm光激发，收集605 nm的发光。,活体细胞内纳米水凝胶的荧光成像,3.3、纳米技术与生物医学（纳米药物载体）,纳米体系/亚微米体系纳米微粒尺寸： 1nm1000nm应用目的： 难溶性药物 难吸收药物 不稳定药物,纳米微粒载体 脂质体 脂质微粒 纳米囊和纳米球 聚合物胶束,A. 纳米脂质体,脂质体是由磷脂（或与附加剂）为骨架膜材制成的，具有双分子层结构的封闭囊状体。药物制成脂质体制剂，具有靶向性、长效作用（缓释性）、降低药物毒性、保护被包封的药物，提高药物稳定性，具有较好的细胞亲和性与组织相容性。脂质体作为制剂新技术，发展已有半个多世纪的历史，但当前仍是药物新剂型研究主要方向.,Liposomes are closed spherical vesicles consisting of a lipid bilayer that encapsulates an aqueous phase in which drugs can be stored. The liposome diameter varies from 400 nm to 2.5 m.,A. 纳米脂质体,在普通脂质体的类脂质双分子层中加入适当表面活性剂，则可形成纳米脂质体。粒径控制在100 nm左右，并用亲水性材料如PEG进行表面修饰的纳米脂质体在静脉注射后，兼具长循环和隐形或立体稳定的特点。对减少肝脏巨噬细胞对药物的吞噬、提高药物靶向性、阻碍血液蛋白质成分与磷脂等的结合、延长体内循环时间等具有重要作用。纳米脂质体也可作为改善生物大分子药物的口服吸收及其他给药途径吸收的载体，如透皮纳米柔性脂质体和胰岛素纳米脂质体等。,The hydrophobic region traps drugs in the central core when the liposomes are prepared. The outer surface can be functionalized with ligands for active targeting or PEGylated. Liposomes can vary in the number of lipid bilayers they possess and can be classified into three categories: (i) multilamellar vesicles, (ii) large unilamellar vesicles and (iii) small unilamellar vesicles.,Diagram of a bilaminar liposome,B. 固体脂质纳米粒（Solid lipid nanoparticles, SLN）,SLN是由多种高熔点脂质材料（如饱和脂肪酸、脂肪醇、硬脂酸、混合脂质等）形成的固体颗粒，其粒径为501000 nm，是一种正在发展的新型纳米给药系统。SLN在室温下为固体，理化性质稳定，兼有聚合物纳米球的物理稳定性高、药物泄漏少、缓释性好的特点，又兼有脂质体毒性低、制备工艺简便，易于大规模生产等优点.主要适合于难溶性药物的包裹，用作静脉注射或局部给药。可以作为靶向定位和控释作用的载体.,C. 纳米囊和纳米球,药物被包裹在载体膜内，称纳米囊（nanocapsule）；药物分散在载体基质中，称纳米球（nanosphere）。纳米囊和纳米球主要由聚乳酸、聚丙交酯己交酯、壳聚糖、明胶等高分子材料制备而成。根据材料的性能，适合于不同给药途径，如静脉注射的靶向作用、肌肉或皮下注射的缓控释作用。口服给药的纳米囊和纳米球也可用非降解性材料制备，如乙基纤维素、丙烯酸树脂等。,D. 聚合物胶束,一类新型的纳米载体合成水溶性嵌段共聚物或接枝共聚物，使之同时具有亲水性基团和疏水性基团，在水中溶解后自发形成高分子胶束，从而完成对药物的增溶和包裹。因为其具有亲水性外壳及疏水性内核，适合于携带不同性质的药物。目前研究较多的是聚乳酸和聚乙二醇的嵌段共聚物，而壳聚糖及其衍生物因其优良的生物降解特性正在受到密切关注。,高分子纳米抗肿瘤药物延长了药物在肿瘤内停留时间，减慢了肿瘤的生长，而且纳米药物载体可以在肿瘤血管内给药，减少了给药剂量和对其他器官的毒副作用。纳米药物载体还可增强药物对肿瘤的靶向性。纳米高分子药物载体还可以通过对疫苗的包裹，提高疫苗吸收和延长疫苗的作用时间。纳米高分子药物载体可用于基因的输送，进行细胞的转染等。,口服胰岛素纳米囊可保护胰岛素不被酶破坏，提高胰岛素的降糖作用；皮下注射胰岛素纳米囊，降糖作用可持续7天，3天1次给药的降糖作用可接近1天3次给药的常规胰岛素治疗效果，并减小血药浓度的波动。作为控释剂的聚乳酸的药效时间，实验最长已经达到200天，一般也可以到12个月。,纳米药物治疗磁介导热疗,将纳米尺度的磁性颗粒定位于肿瘤组织，然后施加一外部交变磁场，使材料因产生磁滞、驰豫或感应涡流而被加热，这些热量再传递到材料周边的肿瘤组织中，使肿瘤组织温度超过42，导致细胞的凋亡及坏死，从而实现对肿瘤的治疗。,磁介导热疗 1：磁性阳离子脂质体,磁介导热疗 2：抗体结合的磁性脂质体,Preparation of chitosan-based multifunctional nanocarriers overcoming multiple barriers for oral delivery of insulin,糖尿病药物,首选疗法：皮下注射胰岛素口服糖尿病药物：双胍类，磺酰脲类，氯茴苯酸类，-葡萄糖苷酶抑制剂，二肽基肽酶4抑制剂和噻嗪二酮类。口服糖尿病药物问题：副反应。 例如，Glimepiride，通常的品牌名称为Amaryl，是一种磺酰脲类药物。 口腔治疗后可能发生恶心和胃部不适。 阿卡波糖（葡糖苷酶抑制剂），通常的品牌名称为Percose，通常用于控制糖尿病患者的高血糖。在治疗的最初几周发生会发生腹泻，气，胃部不适，便秘或胃痛。,开发口服胰岛素制剂的主要障碍,低pH环境（胃）消化酶（胃肠）肠上皮细胞膜吸收障碍 导致 内服总胰岛素的生物利用度1,研究路线,制备羧甲基壳聚糖,纳米胰岛素,加入胰岛素,PBA和LV改性,体外实验,活体实验,Fig. 1.Synthetic routine for preparation of chitosan-based multifunctional nanocarriers,LV，L-缬氨酸，用作促进小肠吸收的靶配体PBA，苯基硼酸，疏水和葡萄糖敏感单元,PBA,LV,FT-IR spectra (B) of carboxymethyl chitosan (CMCS, black), physical mixture of CMCA, 3-APBA and LV (green) and CMCS-PBA-LV (red); 1H NMR spectrum of CMCS-PBA-LV (C).,Fig. 2.SEM image (A), TEM image (B) and DLS distribution in water (C) of insulin-loaded chitosan-based multifunctional nanocarriers, stability of as-prepared nanocarriers in 10% fetal bovine serum (FBS) solution at 37C against incubating time (D).,Fig. 3.Insulin release profiles of insulin-loaded nanocarriers against SGF (pH=1.2) and SIF (pH=6.8) in vitro, and PBS solution with different concentration of glucose (A: T=37C); CD spectra of free and released insulin (B).,Fig. 4.In vitro cell viability of HT-29 cells against the blank nanopcarriers (NCs) and insulin-loaded nanocarriers (INCs) with different concentration (A) and culture time (B) by MTT assay.,Fig. 5.CLSM images of HT-29 cells treated with FITC-insulin loaded chitosan-based nanocarriers. The red signal represents cytoskeleton stained with rhodamine-phalloidin, the blue signal represents nuclei stained with DAPI and the green signal represents FITC-insulin.,Fig. 6.Flow cytometric profiles of HT-29 cells incubated with FITC-insulin-loaded nanocarriers for 0, 1, 3 and 6h (A) and chemical stability of insulin in SGF containing pepsin and SIF containing pancreatin (B).,Fig. 7.Blood glucose levels in diabetic rats following oral administration of insulin-loaded nanocarriers, saline and insulin solution (A); Plasma insulin level in diabetic rats following oral administration of insulin-loaded nanocarriers and insulin solution (B,Schematically illustrated for fabrication of chitosan-based multifunctional nanocarriers overcoming multiple barriers for oral delivery of insulin (C).,结论,通过LV和PBA改性脱乙酰壳多糖为基础的多官能纳米载体可克服胰岛素的口服递送的多重障碍。该纳米载体细胞毒性低，抗消化酶水解。纳米载体装载的胰岛素对糖尿病大鼠表现出明显的降血糖作用和较高的血清胰岛素水平，并能保持较长的时间。,纳米微粒载体的应用特点 小尺寸，大表面积，提高药物溶解度和溶出速度,粒径 表面能 表面能/总能量 比表面积 nm (J.mo1-1) (m2.g-l) 2 2.04105 35.3 452 5 8.16104 14.1 181 10 4.08104 7.6 90 100 4.08103 0.8 9,纳米药物尺度的优势,纳米微粒的大小影响药物的生物利用率。脾静脉窦中内皮细胞的间隙为200500nm，因此长效型微粒最好不要超过200nm大小。而肾脏肾小球中内皮细胞的间隙在4060nm间，过小的微粒会被过滤出。 要使纳米载体在血液循环中流通时间增加，必须控制载体大小的范围。因此，要使纳米載體在血液循環中流通時間增加，必須控制載體大小的範圍。例如，脂質體直徑小於100nm，則在肝細胞中的分布越多，這是因為肝臟竇上皮開窗直徑通常在100150nm，小於這個尺寸的微粒容易穿過血管進入組織。,大分子和颗粒进入细胞,胞 饮 吞 噬,纳米药物的优势,纳米级药物载体可以进入毛细血管，在血液循环系统自由流动，还可穿过细胞，被组织与细胞以胞饮的方式吸收，提高生物利用率。纳米载体的比表面积高，水溶性差的药物在纳米载体中的溶解度相对增强，克服无法通过常规方法制剂的难题。纳米载体经特殊加工后可制成靶向定位系统，如磁性载药纳米微粒。可降低药物剂量减轻副作用。,纳米药物的优势,延长药物的体内半衰期，藉由控制聚合物在体内的降解速度，能使半衰期短的药物维持一定水平，可改善疗效及降低副作用，减少患者服药次数。可消除特殊生物屏障对药物作用的限制，如血脑屏障、血眼屏障及细胞生物膜屏障等，纳米载体微粒可穿过这些屏障部位进行治疗。,药物可控释放药物的控制释放也称为可控给药体系，是通过物理、化学等方法改变制剂结构，使药物在预定时间内，自动按某一速度从剂型中恒速释放于作用器官或特定靶组织，并使药物浓度较长时间维持在有效浓度内的一类制剂。药物控释剂型：微胶囊、微球、纳米粒子、共混膜、棒、纤维、空心纤维、海绵、水凝胶、片剂、贴剂以及水溶性大分子载体等。4）运载药物通过生物屏障纳米粒子经过适当的修饰，可通过血脑屏障，把药物定向输送到中枢神经系统而发挥作用。吐温-80修饰亮啡肽类药的聚氰基丙烯酸丁酯,Targeted Delivery to Tumors,Goal is to inject treatment far from tumor and have large accumulation in tumor and minimal accumulation in normal cells/organs.,抗癌药剂对实体癌部位置的选择性输送,Cancer Treatments,Tumor penetration is a key issue for successful chemotherapy,坏死细胞,静止细胞,增殖细胞,EPR Effect,癌细胞的EPR效应,1986年，日本熊本大学前田浩教授提倡EPR效果(Enhanced Permeation and Retention effect)(EPR效应) 。EPR效应，即是癌细胞会分泌比正常细胞多的vascular permeability factor，造成肿瘤组织附近血管比起正常的血管物质渗透性高，因此分子体积大的高分子化合物更能渗透、经过癌组织。加上癌细胞破坏淋巴系统，造成高分子化合物停留在肿瘤组织附近时间较长的现象。被动的(passive)特定目标药物比较能将血液中的药物送入癌细胞中。因此，自1986年以来，对固体癌细胞的特定目标药物，就从以前对抗原-抗体反应的积极性特定目标药物，改用抑制肝脏、肾脏代谢或运用徐放的被动特定目标药物而出现了新的开始。,Nanoparticle use in Cancer Treatments,Because of their small size, nanoparticles can pass through interstitial spaces between necrotic and quiescent cells.Tumor cells typically have larger interstitial spaces than healthy cellsParticles collect in center bringing therapeutics to kill the tumor from inside out.,纳米载药微粒,尺度：直径10500 nm的固态胶体粒子构造：药物通过溶解、包裹作用位于粒子内部, 或通过吸附、耦合作用位于粒子表面特点：长循环、缓释、靶向,纳米微粒 长循环 靶向、缓释,物理化学导向生物导向,Nanotechnology Based Drug Delivery Systems for Cancer Therapy,Schematics - Reproduced from Sahoo and Labhasetwar, 2003 with kind permission from Drug Discovery Today.,/CT3A/HTML/13.%20Orive%20et%20al,%20131-138%20.html 2005,靶向技术的研究主要在物理化学导向和生物导向两个层次上进行。物理化学导向利用药物载体的 pH敏、热敏、磁性等特点在外部环境的作用下（如外加磁场）对肿瘤组织实行靶向给药。 生物导向利用抗体、细胞膜表面受体或特定基因片段的专一性作用，将配位子结合在载体上，与通过特异性结合，使药物能够准确送到肿瘤细胞中。,靶向物质与纳米载体结合时存在结合率低、毒性高等问题,利用药物载体的磁性特点，在外加磁场的作用下，磁性纳米载体将富集在病变部位，进行靶向给药。,纳米载药微粒：物理化学导向,Magnetophoretically guided drug delivery together with light-activated photodynamic therapy,Targeted Paclitaxel by Conjugation to Iron Oxide and Gold Nanoparticles,83 paclitaxel molecules/nanoparticles,磁性阿霉素纳米粒,磁性阿霉素纳米粒在磁场中的定向运动,聚乳化工艺形成的磁性阿霉素纳米粒的电镜照片,加磁场,肿瘤组织,正常组织,未加磁场,加磁场，经磁性阿霉素纳米粒治疗，60天后肿瘤组织被纤维组织和无结构的组织所代替，找不到癌细胞的存在,荧光修饰的抗体进行识别和定位,利用抗体、细胞膜表面受体的专一性作用，将配位子结合在载体上，与目标表面的抗原性识别器发生特异性结合，使药物能准确地作用于目的细胞。,纳米载药微粒：生物导向,Examples of nanocarriers for targeting cancer,A whole range of delivery agents are possible but the main components typically include a nanocarrier, a targeting moiety conjugated to the nanocarrier, and a cargo (such as the desired chemotherapeutic drugs).,Schematic diagram of the drug conjugation and entrapment processes. The chemotherapeutics could be bound to the nanocarrier, as in the use of polymerdrug conjugates, dendrimers and some particulate carriers, or they could be entrapped inside the nanocarrier.,Examples of nanocarriers for targeting cancer,Approved forOvarian Cancer卵巢癌AIDS-related Karposis Sarcoma AIDS相关性弓形虫肉瘤Multiple Myeloma 多发性骨髓瘤The STEALTH liposome methoxypolyethylene glycol (mPEG) containingAntitumor antibioticInterferes with cell divisionHalf life 55 hours in humans 100 nm sizeProduced by Ben Venue Labs, - Bedford, OH, contract mfg Div. of Boeringer IngelheimDistributed by Centocor Ortho Biotech, Inc Horsham, PA private, Div. of J&JSTEALTH and DOXIL are trademarks of ALZA Corporation, Div. of J&J,Doxil - Approved,Abraxane - Approved,Approved for Breast CancerAlbumin-bound PaclitaxelPaclitaxel powerful anticancer drug not water solubleAbraxane is water soluble reduces treatment to 30 min from 3 hrs for solvent version & its side effects130 nmAmerican Pharmaceutical Partners and American BioScience, Inc approved by FDA 05Jan05Produced by Abraxis BioScience Los Angeles, CA,Drugs are delivered to tumors by leaky junctions in the blood vessels. Drugs also bind to albumin and are transported in the blood and delivered to tumors. This is accomplished first by taking advantage of the transport system (gp60 pathway) across the endothelial cells and then concentrating within the tumor interstitium by its affinity for SPARC (Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine). Finally, the water insolubility of many active chemotherapy agents is overcome by using proteins instead of additional chemicals to dissolve the active drug., 紫杉醇及其临床用制剂,紫杉醇是一种广谱抗癌药，对多种恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、头颈部肿瘤、胃癌、淋巴瘤等都显示出较肯定的临床疗效。紫杉醇不溶于水,目前在临床上使用的紫杉醇注射液Taxol以聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇作助溶剂（约1：1比例）。无靶向作用特征聚氧乙烯蓖麻油本身具有生物学效应：1. 安全性的影响：严重过敏反应；神经毒性；骨髓抑制（协同作用）等2. 有效性的影响：剂量受限制；非线性消除；量效关系不易预测等3. 稀释不稳定性：存在药物析出的风险（长时间放置）4. 使用不方便性：需使用特殊的输液导管，并滴注时间较长（3小时）, 紫杉醇白蛋白纳米粒,Nanoparticles 白蛋白纳米粒特点：白蛋白亲水性水中可自组装纳米粒疏水区与紫杉醇弱结合冻干制剂优良骨架对药物有稳定作用白蛋白生物学功能,注射用紫杉醇（白蛋白结合型) Abraxane,平均粒径 = 130 nm,紫杉醇,白蛋白,电子显微镜下的纳米粒图, Abraxane 毒性较低,Abraxane 在小鼠的半数致死剂量（LD50）比 Taxol 高约1.5倍Abraxane 在动物中的骨髓抑制作用及神经毒性均较 Taxol 轻, Abraxane 肿瘤靶向性,Abraxane 在肿瘤组织中的分布较正常组织高;移植了MX-1人乳癌组织的裸鼠接受等剂量的Abraxane 或Taxol 后，裸鼠乳癌组织内的紫杉醇浓度Abraxane 组比Taxol 组高1.33倍。,0.0,0.5,1.0,1.5,肿瘤,肌肉,心脏,肾脏,肺,脾脏,血液,紫杉醇含量比例(ABX/Taxol),正常组织,等剂量Abraxane 与 Taxol 在荷瘤裸鼠组织分布的比较 MX-1荷瘤裸鼠20mg/kg（n=5)，给药1h后,P0.008(所有组织）, Abraxane 肿瘤靶向性,荷瘤小鼠接受等剂量Abraxane或Taxol后 肿瘤组织紫杉醇含量的比较,Abraxane = 1.33 X Taxol, Abraxane 疗效提高,MX-1人乳腺癌荷瘤小鼠接受等剂量Abraxane与Taxol（30mg/kg）疗效比较, Abraxane 毒性降低,等毒性剂量Abraxane与Taxol对不同荷瘤裸鼠的疗效比较(每组N = 5， IV qd x 5 days),Prostate,Ovarian,Lung,Desai N, Yao Z, Soon-Shiong P, et al. Evidence of enhanced in vivo efficacy at maximum tolerated dose (MTD) of nanoparticle paclitaxel (ABI-007) and Taxol in 5 human tumor xenografts of varying sensitivity to paclitaxel abstract. Proc Am Soc Clin Oncol. 2002;21:116a. Abstract 462., Abraxane 作用机制探讨,Abraxane通过其药物中的白蛋白、组织细胞膜上的白蛋白受体（Gp60）、胞膜上的窖蛋白（Caveolin-1)，以及肿瘤组织中的SPARC，使其紫杉醇更容易地聚集在肿瘤组织中在血浆中的蛋白（如白蛋白）离开血循环到达组织（肿瘤组织）主要通过两个途径：细胞旁通道 经过内皮细胞间隙（Intercellular Junction)经过细胞膜上移动小泡（如胞膜窖蛋白Caveolin）的作用进行转运（Vesicles Trafficking），将蛋白从细胞膜一侧转运到细胞膜另一侧（Transcytosis）,聚氧乙烯蓖麻油抑制Caveolin介导的转胞吞作用,Abraxane 紫杉醇穿过细胞层比Total 紫杉醇高 4.2倍-methylcyclodextrin 能抑制 nab-紫杉醇的细胞转运, 提示 Caveolae 可能是主要的转运机制,Taxol (Cremophor),nab-paclitaxel,nab + b-methyl cyclodextrin,4.2X Greater Transport of Nab-Paclitaxel,Exploiting the gp60 Pathway to Preferentially Feed the Tumor Albumin - Bound Paclitaxel,SPARC（Secreted Pro